基于α-葡萄糖苷酶三維結構的分子設計及其突變體在大腸桿菌中的高效表達.pdf

1、目的：使用PCR技術獲得α-葡萄糖苷酶基因序列，通過SWISS-MODEL服務器對α-葡萄糖苷酶結構進行預測，結合氨基酸的性質(zhì)特點，對酶蛋白進行分子設計，采用PCR突變試劑盒對其進行定點突變，并在大腸桿菌中表達，測定了重組菌、突變菌的酶活力，為進一步研究α-葡萄糖苷酶結構與功能的關系奠定了基礎。 方法：根據(jù)GenBank中登錄的α-葡萄糖苷酶的核酸序列設計PCR引物，并在上游引物的5'端加上EcoRⅠ酶切位點，在下游引物的5'端

2、加上HindⅢ酶切位點。從嗜熱脂肪芽孢桿菌U2中提取基因組DNA，應用PCR擴增出α-葡萄糖苷酶的核酸序列與pUC18經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍白篩選，挑出陽性菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序，測序正確后將陽性重組質(zhì)粒和表達載體pGEMEX-1經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21pLysS，經(jīng)篩選后挑取菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序，軟件模擬α-葡萄糖苷酶蛋白結構，尋找合適的突變位點，

3、設計突變引物，用突變試劑盒對α-葡萄糖苷酶蛋白序列的203、258位進行突變，表達突變體。將克隆重組菌株、表達重組菌株和突變重組菌株的酶活力進行測定比較。同時將陽性菌落用IPTG誘導表達3小時，全菌體蛋白SDS-PAGE電泳觀察表達結果。 結果：1.經(jīng)PCR技術自嗜熱脂肪芽孢桿菌U2基因組DNA中克隆了編碼α-葡萄糖苷酶的基因，測序結果與Genbank上登錄的相應基因一致。 2.使用瑞士日內(nèi)瓦生物醫(yī)學研究所的SWISS-

4、MODEL服務器預測了α-葡萄糖苷酶的三維結構，并使用SWISSPDBViewer構建突變體模型，使用評估軟件對模型結構分析，達到合理化結果。 3.本研究使用TaKaRaMutanBESTKit將258位與203位氨基酸定點突變，達到預期突變結果。 4.構建的表達體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21pLysS，抽提重組質(zhì)粒鑒定，測序結果表明連接方向正確，可以進行誘導表達。 5.經(jīng)過酶活力檢測，在表達重組體比出發(fā)菌株產(chǎn)酶活力提