熒光素酶標記的重組流感病毒(IAV-Gluc)構(gòu)建及其呼吸道沉積可視化研究.pdf

1、近年來，頻繁爆發(fā)的甲型流感不僅給人類的生命健康帶來了嚴重威脅，而且給經(jīng)濟造成了巨大損失，甚至影響到了社會穩(wěn)定。通過氣溶膠傳播、擴大感染范圍是其能引起全球大流行的一個重要因素。2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感就是因病毒能經(jīng)氣溶膠傳播，具有強大的人傳人能力，而被世界衛(wèi)生組織（WHO）將警戒級別提至最高級—6級。該事件進一步引發(fā)了人們對流感病毒氣溶膠傳播機理研究的關(guān)注。但是目前對于流感病毒的氣溶膠傳播機制還不是十分清楚。影響流感病毒氣溶膠傳播

2、效率的因素有很多，如環(huán)境因素、流感病毒自身的關(guān)鍵位點氨基酸序列、宿主呼吸道唾液酸相關(guān)的受體類型、體內(nèi)的抗病毒藥物或疫苗免疫水平、在呼吸道的沉積效率等。與研究病毒氣溶膠擴散動力學同等重要的是，監(jiān)測具有氣溶膠傳播特性的流感病毒在感染宿主過程中呼吸道內(nèi)載量的動態(tài)變化，能為流感病毒的組織嗜性、復制與清除規(guī)律、致病與傳播分子機制的研究提供基礎數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐，對于進一步研究流感病毒的氣溶膠傳播機制具有重大意義。目前，傳統(tǒng)的病毒體內(nèi)沉積研究方法需要大

3、量使用動物，在不同的時間點剖檢，不僅費時、費力，而且存在較大的生物安全隱患。而活病毒標記及可視化研究能夠有效克服上述不足，可以實時、便捷地反映病毒感染過程。
　　本課題利用反向遺傳操作技術(shù)，在甲型H1N1流感病毒A/PuertoRico/8/34(PR8)的NA末端插入外源熒光素酶基因Gluc（Gaussia luciferase），構(gòu)建可視化的重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒（IAV-Gluc），為開展流感病毒動物感染研究提供了

4、一種實時、動態(tài)、可視化監(jiān)測呼吸道病毒載量變化的方法。該方法通過檢測活體動物呼吸道生物發(fā)光情況，快速確定病毒的組織分布及載量情況，實現(xiàn)對動物體內(nèi)病毒載量連續(xù)、實時的動態(tài)監(jiān)測，具有操作簡便、結(jié)果直觀、可快速定性定量等特點。
　　本研究共分四部分：
　　一是完成了IAV-Gluc的構(gòu)建與鑒定。以A/Puerto Rico/8/34(PR8)毒株為骨架，利用反向遺傳學技術(shù)成功構(gòu)建8個雙向轉(zhuǎn)錄/表達質(zhì)粒，將8個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞（

5、人胚胎腎細胞），轉(zhuǎn)染上清接種9日齡的SPF雞胚，進行重組病毒IAV-Gluc拯救。通過凝集試驗（HA）、基因擴增、形態(tài)學觀察、熒光素酶基因表達水平的驗證和鑒定，均證實了重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒（IAV-Gluc）構(gòu)建成功，且該病毒能夠穩(wěn)定表達Gluc。
　　二是完成了IAV-Gluc生物學特性研究。本研究從穩(wěn)定性、致病性、傳播能力、增殖能力、NA活性及受體結(jié)合特性六個方面對拯救毒株IAV-Gluc的生物學特性進行了分析比較

6、。結(jié)果表明，IAV-Gluc能夠在P1-P5代穩(wěn)定表達熒光素酶基因，且在5代間表達無顯著差異；致病力約為野生毒PR8的1/1000；在豚鼠間獲得了100％的直接接觸傳播與氣溶膠傳播能力，與野生毒株一致；在SPF雞胚上增殖能力約為野生毒的1/20，增殖曲線無明顯差異；與野生毒的神經(jīng)氨酸酶相對活性不存在顯著性差異，表明對病毒的釋放能力無影響；二者均表現(xiàn)出完全的α2,3唾液酸受體結(jié)合能力。上述結(jié)果表明獲得的IAV-Gluc除致病力減弱外，極大

7、地保留了野生毒株的生物學特性。
　　三是完成了IAV-Gluc在呼吸道內(nèi)沉積的可視化監(jiān)測研究。本研究結(jié)合體外成像技術(shù)，分析了病毒在小鼠體內(nèi)復制、清除的動態(tài)過程。以IAV-Gluc滴鼻感染BALB/c小鼠（5×103EID50/只）后，利用IVIS SPECTRUM體外成像系統(tǒng)對其體內(nèi)的病毒載量進行連續(xù)6天的可視化監(jiān)測，24h即能在體外檢測到生物發(fā)光信號，48h后達到峰值。生物發(fā)光來源為小鼠肺部和氣管，且肺部的生物熒光強度與病毒滴度

8、有極強的正相關(guān)線性關(guān)系（R2=0.9866）；同時，建立了生物發(fā)光快速鑒定病毒感染的方法，相比于傳統(tǒng)的qRT-PCR技術(shù)來說，不僅可以直接評價動物體內(nèi)活病毒載量，而且在保證準確性前提下，大大縮短了樣品處理步驟和實驗所需時間。
　　四是完成了不同感染方式下IAV-Gluc在呼吸道內(nèi)沉積與復制的比較研究。當保證滴鼻與氣溶膠暴露兩種方式下攻毒的劑量相同（2.43×105 EID50）時，滴鼻時有12.27%的病毒到達豚鼠肺部且呈點狀分布

9、，氣溶膠暴露時有1.34%的病毒到達豚鼠肺部且呈均勻分布，后者導致病毒在48h內(nèi)更加有效的復制；從復制效率來看，氣溶膠暴露感染組的豚鼠肺部病毒載量持續(xù)增高48h后才開始下降，最高載量為原始沉積量的11073倍，而滴鼻感染組的豚鼠肺部病毒載量在24h開始下降，且最高載量僅為原始沉積量的15.4倍。說明氣溶膠暴露方式感染更有利于病毒在肺部的復制，比滴鼻方式具有更高的感染效能。
　　本研究成功構(gòu)建了攜帶Gaussia Luciferas

10、e基因的可視化重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒（IAV-Gluc）；從穩(wěn)定性、致病性、傳播能力、增殖能力、NA活性及受體結(jié)合特性等方面鑒定，結(jié)果顯示該重組病毒極大地保留了野生毒株的生物學特性；滴鼻感染小鼠后在肺部和氣管內(nèi)可檢測到生物發(fā)光信號，并且生物發(fā)光強度與病毒滴度呈正相關(guān)；該病毒適用于對感染動物的快速鑒定研究，在前處理和檢測時間上優(yōu)于傳統(tǒng)的qRT-PCR技術(shù)，而且能夠直接評價體內(nèi)的活病毒載量；同時，利用可視化病毒進行氣溶膠暴露研究首