角蛋白聚乙烯醇復(fù)合神經(jīng)支架的構(gòu)建及其細(xì)胞相容性的研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生與修復(fù)是神經(jīng)組織工程中倍受關(guān)注的問(wèn)題。相比于直接修復(fù)、自體/異體神經(jīng)移植等治療方法，神經(jīng)支架為解決神經(jīng)來(lái)源有限、移植成功率低、排斥反應(yīng)嚴(yán)重和修復(fù)范圍不廣等難題帶來(lái)了新希望。作為神經(jīng)組織工程的應(yīng)用主體，神經(jīng)支架為神經(jīng)再生與修復(fù)提供了最佳的生物微環(huán)境，支持細(xì)胞粘附增殖，引導(dǎo)細(xì)胞分化遷移，減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)，達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生與神經(jīng)組織修復(fù)的目的。角蛋白是具有臨床應(yīng)用前景的功能型神經(jīng)支架材料，它來(lái)源天然取材豐富、免疫原性低

2、、降解吸收性好。但角蛋白粘度低極性小、成紡性較差，這使得制備單一角蛋白支架十分困難。前期研究中，已有學(xué)者將多種生物材料與角蛋白混合共紡納米纖維用于組織工程，但角蛋白與其他材料混紡會(huì)影響纖維的力學(xué)性能，并且混紡的復(fù)合納米纖維表面不能保證角蛋白覆蓋，這也影響了角蛋白混合纖維的生物性能?；诖?，本課題使用靜電紡絲技術(shù)制備了表面負(fù)載角蛋白納米顆粒的聚乙烯醇（PolyvinylAlcohol，PVA）復(fù)合纖維支架（KeratoseNanopart

3、icles-coated-PVAfibers，KosNPs/PVA）用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，角蛋白/PVA混合纖維支架（KOS/PVAcompositefibers，KOS/PVA）在本研究中也進(jìn)行制備作為對(duì)照。KosNPs/PVA支架由PVA纖維作為骨架，并且表面附著角蛋白納米顆粒，與KOS/PVA納米纖維相比更具有增強(qiáng)細(xì)胞相容性的潛力。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論：
　　1.采用氧化法提取人發(fā)角蛋白，對(duì)氧化型角蛋白（Keratos

4、e，KOS）進(jìn)行提取率、蛋白定性和氨基酸定量分析。①用該法成功提取KOS，SDS-PAGE電泳圖顯示蛋白分子量約為40kDa，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；②被檢測(cè)出的氨基酸共17種，絲氨酸，谷氨酸和蘇氨酸含量相對(duì)較高；③氨基酸含量穩(wěn)定在50％以上。說(shuō)明氧化劑過(guò)氧乙酸選取合適，提取的蛋白可用于復(fù)合支架的制備。
　　2.利用靜電紡絲技術(shù)制備角蛋白復(fù)合支架，對(duì)微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)及生物學(xué)性能進(jìn)行考察。①按照一定配比（KOS:PVA=1:2.5，1:5，1:

5、7.5，1:10），成功制備KosNPs/PVA和KOS/PVA；②SEM表征結(jié)果發(fā)現(xiàn)：KosNPs/PVA中的角蛋白納米顆粒呈球形附著于纖維上，形成了納米顆粒附著纖維的微觀結(jié)構(gòu)，底層纖維相互交疊，因而支架具有高度聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu)。同時(shí)，KOS/PVA也具有典型的纖維結(jié)構(gòu)。③FTIR和XRD測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備兩種不同結(jié)構(gòu)復(fù)合神經(jīng)支架對(duì)KOS和PVA的化學(xué)結(jié)構(gòu)與晶型沒(méi)有明顯影響；④水接觸角結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合支架具有強(qiáng)親水性，且隨

6、著角蛋白含量的增加而親水性顯著增加。KosNPs/PVA1:101:7.51:51:2.5組的接觸角分別為25.1±1.8o，23.2±1.3o，17.1±1.9o，15.7±2.0o，說(shuō)明角蛋白表面親水的酰胺基側(cè)鏈和絲氨酸存在，增加了支架的親水性，且納米顆粒附著纖維的微觀結(jié)構(gòu)對(duì)其親水性的增加沒(méi)有顯著影響；⑤力學(xué)性能結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組KosNPs/PVA的力學(xué)性能沒(méi)有明顯差異，與純PVA纖維支架的力學(xué)性能接近，說(shuō)明納米粒附著纖維的微觀結(jié)構(gòu)沒(méi)

7、有影響纖維的力學(xué)性能。但KOS/PVA復(fù)合支架的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量與KosNPs/PVA相比較高。
　　3.綜合上述表征結(jié)果，本研究選取KosNPs/PVA1:7.5，1:5組作為實(shí)驗(yàn)組，KOS/PVA1:7.5，1:5組作為對(duì)照組，考察不同類型角蛋白復(fù)合支架的細(xì)胞相容性。分別選用大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞模擬神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育模型，考察細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)增殖情況以及NCAM、GAP-43、MAP-

8、2、GFAP基因的表達(dá)。①細(xì)胞形態(tài)結(jié)果表明，兩種角蛋白復(fù)合支架能很好的支持細(xì)胞生長(zhǎng)，但PC12細(xì)胞和C6細(xì)胞在KosNPs/PVA上顯示出更好的生長(zhǎng)活力，說(shuō)明纖維表面角蛋白納米顆粒的附著可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；②粘附結(jié)果表明，PC12細(xì)胞粘附力依次是KOS/PVA組＞KosNPs/PVA組＞PVA組，C6細(xì)胞是KosNPs/PVA組＞KOS/PVA組＞PVA組，說(shuō)明角蛋白在纖維表面的包覆有助于細(xì)胞的粘附，但C6細(xì)胞對(duì)角蛋白的響應(yīng)更敏感；③增殖結(jié)

9、果表明，0-24h內(nèi)，各組支架培養(yǎng)的PC12、C6細(xì)胞增殖活力沒(méi)有明顯差異。24-48h內(nèi)，KosNPs/PVA組支架上的細(xì)胞增殖活力加強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量增多。說(shuō)明纖維表面的角蛋白有營(yíng)養(yǎng)、支持細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。④基因表達(dá)結(jié)果表明，與KOS/PVA相比，KosNPs/PVA復(fù)合支架可以上調(diào)PC12細(xì)胞的NCAM、GAP-43、MAP-2的表達(dá)，能增強(qiáng)細(xì)胞與支架材料的粘附，促進(jìn)微管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。KosNPs/PVA組的C6細(xì)胞N