對二型糖尿病肝糖原的連接機(jī)制和病理結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、肝糖原是哺乳動物體內(nèi)重要的能量儲存物質(zhì)。糖原在體內(nèi)分布廣泛，人體內(nèi)主要集中在肝臟和骨骼肌，其中肝糖原能夠維持體內(nèi)的血糖平衡。從結(jié)構(gòu)上來看，糖原是由葡萄糖單體組成的高度分枝化的高分子物質(zhì)，可以劃分為三種不同的結(jié)構(gòu)層級：一級結(jié)構(gòu)由葡萄糖單體通過α-(1,4)鍵形成直鏈，通過α-(1,6)鍵形成支鏈，平均支鏈的長度大概是12個葡萄糖單體；二級結(jié)構(gòu)由這些直鏈和支鏈連接成β粒子，直徑大概在20nm左右；三級結(jié)構(gòu)是由β粒子連接成的更大粒徑的α粒子，

2、直徑大概在100nm。
　　本課題研究集中在第三級結(jié)構(gòu)層面，主要研究肝糖原小粒徑β-粒子結(jié)合成大粒徑α-粒子的蛋白質(zhì)。通過對比db/db小鼠（一種二型糖尿病模型）的肝糖原與正常小鼠肝糖原的結(jié)構(gòu)差別，找出肝糖原結(jié)合蛋白并研究這種差異與肝糖原結(jié)合蛋白的定性定量關(guān)系，以期尋找治療糖尿病的新型藥物靶點(diǎn)。
　　本論文由四個部分組成。
　　第一部分，建立將肝糖原分子與其表面結(jié)合蛋白分離純化的可行性方法。第一：使用胰蛋白酶將肝糖原表

3、面結(jié)合蛋白降解成多肽，并通過超濾離心管（MWCO）除去，同時用分析型體積排阻色譜（SEC）檢驗(yàn)肝糖原是否會降解；第二：使用制備型SEC根據(jù)肝糖原分子與蛋白質(zhì)分子大小的差異來分離純化肝糖原。然后，將兩種方法分離純化得到的肝糖原使用α-淀粉酶降解以釋放肝糖原分子當(dāng)中所有的蛋白質(zhì)，再用高分辨質(zhì)譜儀（Triple-TOF）進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，以蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)中含有肝糖原相關(guān)蛋白最少者確立為最佳分離純化方法。經(jīng)過蛋白質(zhì)組學(xué)定性分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胰蛋白酶降

4、解方法純化的肝糖原分子仍可以結(jié)合多種雜質(zhì)蛋白；但是經(jīng)制備型SEC純化之后的肝糖原只含有一種與肝糖原分子相關(guān)蛋白-glycogenin，其余為實(shí)驗(yàn)操作過程當(dāng)中摻入的雜質(zhì)蛋白。發(fā)現(xiàn)通過制備型SEC純化后的肝糖原分子具有最純凈最準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)組。
　　第二部分，在體外通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)出被檢測出的肝糖原連接蛋白，并進(jìn)行體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)該連接蛋白能夠成功將小粒徑β-粒子連接成大粒徑的α-粒子。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將表達(dá)該蛋白的基因剪切進(jìn)大腸桿菌

5、質(zhì)粒載體中，并將該載體轉(zhuǎn)染入大腸桿菌中進(jìn)行培養(yǎng)，表達(dá)出目標(biāo)蛋白，然后通過多種手段檢測蛋白活性并降解掉其表面的多糖，再與小鼠體內(nèi)提取出的肝糖原進(jìn)行混合反應(yīng)，檢測肝糖原粒徑大小，以提供該肝糖原結(jié)合蛋白作為肝糖原連接分子的直接證據(jù)。Glycogenin分子具有多糖連接活性，通過體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該結(jié)論并研究其連接機(jī)制，目前仍在進(jìn)行中。
　　第三部分，采用蛋白組學(xué)分析方法，尋求將小粒徑β-粒子連接成大粒徑α-粒子的關(guān)鍵蛋白。然后將所得到的蛋

6、白質(zhì)進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，探索在相應(yīng)質(zhì)譜條件下對痕量蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的可行性，并確認(rèn)可靠的定量條件，比較糖尿病小鼠和正常小鼠體內(nèi)該連接蛋白的定量差異。提出糖尿病肝糖原的病理結(jié)構(gòu)模型，并使用SEC和熒光輔助毛細(xì)管電泳（FACE）等多種檢測手段對該病理模型進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的肝糖原與正常小鼠體內(nèi)肝糖原的連接蛋白在β-粒子分子內(nèi)部存在顯著差異，前者肝糖原β-粒子內(nèi)部的glycogenin蛋白即使不經(jīng)α-淀粉酶處理也能被胰蛋白