SIRT3對小鼠心肌肥厚中線粒體脂質代謝障礙及纖維化的影響及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　論文Ⅰ SIRT3對小鼠心肌肥厚中線粒體脂質代謝障礙的影響及其機制研究
　　研究目的:
　　1.探討SIRT3在心肌肥厚中是否具有保護作用。
　　2.探討SIRT3對心肌肥厚中線粒體脂質代謝的影響。
　　3.研究過表達SIRT3是否能夠減輕肥厚心肌細胞中脂質累積。
　　研究方法:
　　1.實驗動物:
　　所有動物實驗均符合國家衛(wèi)生部動物管理辦法（文案號

2、No.55，2001）和山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定。SIRT3-KO小鼠購自美國Jackson實驗室，6-7周齡雄性129野生型小鼠購自北京大學動物研究所。
　　2.構建小鼠心肌肥厚模型:
　　我們給予8周齡雄性小鼠（年齡匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠）以胸主動脈縮窄術(TAC)。我們采用戊巴比妥鈉對動物進行麻醉，將胸主動脈從周圍組織中分離出來，于兩側頸總動脈之間放置27號空針針頭(27-gau

3、ge needle)然后進行手術縫線結扎，迅速將針頭移除。除結扎外，假手術組動物被給予相同處理。所有動物在術后6周處死，將小鼠心臟取材進行肥厚指標和脂質分析等方面的研究。
　　3.免疫組織化學:
　　取材后，組織切片進行HE染色觀察形態(tài)，進行Masson染色來評估膠原含量。膠原含量采用自動圖像分析軟件(Image Pro Plus)進行定量分析。
　　4.超聲心動圖:
　　采用VisualSonics Vevo7

4、70小動物超聲進行左室長軸測量，分別采用M-mode、二維超聲心動圖(2-D)、脈沖多普勒超聲(Pulse Wave Doppler， PWD)等模式進行圖形采集并分析。
　　研究結果:
　　1.SIRT3在小鼠肥厚心肌中表達降低
　　我們給予小鼠TAC術，并觀察6周。為確保主動脈結扎成功，我們利用超聲心動圖探查主動脈結扎部位并測量其血流速度。我們通過計算小鼠心重與體重比值，發(fā)現小鼠心臟在結扎2周、4周、6周后分別產生

5、20％、40％、60％的心肌肥厚。此外，我們發(fā)現與假手術組相比，短片段SIRT3在TAC術后明顯降低;而長片段SIRT3在輕度肥厚時輕度上升，在嚴重肥厚時并無明顯表達變化。這些結果與Sundaresan等在類似心肌肥厚疾病模型中獲得的結論一致，證實了短片段的去乙?；鞍譙IRT3在小鼠肥厚心肌中表達降低。
　　2.SIRT3-KO小鼠在TAC術后易于形成心肌肥厚
　　為進一步研究SIRT3在心肌肥厚中所起的作用，我們給與SI

6、RT3-KO小鼠及野生型小鼠TAC術。我們發(fā)現與野生型小鼠相比，SIRT3-KO小鼠TAC術后肥厚程度更加嚴重(15％)。在假手術組，SIRT3-KO小鼠亦出現比野生型小鼠更高的心重體重比。組織學檢查顯示，無論在TAC還是假手術組，SIRT3-KO小鼠心肌中表現出更加嚴重的細胞壞死和心肌纖維化。我們利用超聲心動圖對小鼠心臟進行無創(chuàng)評價:SIRT3-KO小鼠左室后壁在基礎水平及TAC術后均較野生型小鼠更厚。此外，左室短軸縮短率(Fract

7、ion Shortening，FS)分析顯示SIRT3-KO小鼠更加容易形成嚴重收縮功能障礙。這些研究發(fā)現SIRT3-KO小鼠在TAC術后易于出現心臟功能受損及心力衰竭，提示SIRT3在心肌肥厚的過程中發(fā)揮重要作用。
　　3.SIRT3-KO小鼠心肌中出現過度脂質積累及脂肪酸氧化速率降低
　　我們利用透射電子顯微鏡觀察小鼠肥厚心肌，結果顯示肥厚心肌中線粒體形態(tài)出現嚴重病變。SIRT3-KO在正常情況下未表現出明顯的心肌表型變

8、化;野生型和SIRT3-KO小鼠在TAC術后出現明顯的脂質累積;但是與野生型小鼠相比，SIRT3-KO小鼠出現更明顯的線粒體腫脹，線粒體嵴紊亂以及線粒體內出現大量的泡沫。我們運用其他代謝學檢測方法對小鼠心肌檢查后發(fā)現，甘油三酯及膽固醇水平在TAC術后均升高，在SIRT3-KO小鼠心肌中甘油三酯升高的更加明顯，提示心肌細胞脂肪酸氧化功能受損，同時驗證了電鏡掃描結果。為了直接評估脂肪酸氧化能力，我們利用棕櫚酸氧化率進行測算。在野生型小鼠中，

9、棕櫚酸氧化率降低30％，而在SIRT3-KO小鼠中，棕櫚酸氧化率在正常和肥厚狀態(tài)下均明顯降低?？傊?，結果顯示SIRT3-KO小鼠在心肌肥厚刺激后出現過度脂質累積和脂肪酸氧化率降低。
　　結論:
　　1.SIRT3具有減輕心肌肥厚反應的作用。
　　2.SIRT3可以改善心肌肥厚中線粒體脂質代謝障礙。
　　3.SIRT3可以通過調節(jié)LCAD乙酰化狀態(tài)改善心肌細胞線粒體脂肪酸氧化。
　　論文Ⅱ SIRT3激活對小

10、鼠心肌肥厚中纖維化的影響及機制研究
　　研究目的:
　　1.探討SIRT3對壓力超負荷引起的心肌纖維化的影響。
　　2.研究白藜蘆醇對小鼠心肌中SIRT3表達水平的影響。
　　3.探討SIRT3激活通過何種途徑減輕心肌纖維化。
　　研究方法:
　　1.實驗動物:
　　所有動物實驗均符合山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定和國家衛(wèi)生部動物管理辦法（文案號No.55，2001）。6-7周

11、齡雄性129野生型小鼠購自北京大學動物研究所，SIRT3-KO小鼠購自美國Jackson實驗室。
　　2.動物飲食:
　　我們在實驗中給予動物熱量攝入限制飲食(CR)，普通對照飲食(ControlDietary，CD)及白藜蘆醇補充飲食(RSV supplemental，RSV)。根據AIN-93M(BioServ，Frenchtown，NJ)飲食推薦，我們給予CD組小鼠每周86.4 kcal的食物熱量供應，給予CR組小鼠每

12、周64.8 kcal的食物熱量供應。RSV組小鼠給予普通對照飲食加1.8mg/kg/天的含RSV的飼養(yǎng)用水供應。
　　3.構建小鼠心肌纖維化模型:
　　我們采用胸主動脈縮窄術(TAC)建立8周齡雄性小鼠（年齡匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠）反應性心肌纖維化動物模型。我們采用戊巴比妥鈉對動物進行麻醉，將胸主動脈從周圍組織中分離出來，將27號空針針頭(27-ga ugeneedle)放置于兩側頸總動脈之間，然后進行手術縫

13、線結扎，迅速將針頭移除。除結扎外，假手術組動物被給予相同處理。所有動物在術后8周處死，將小鼠心臟取材進行肥厚和纖維化等方面的研究。
　　研究結果:
　　1.RSV可升高小鼠心肌SIRT3表達水平
　　我們給予野生型小鼠組熱量攝入限制飲食(CR)和白藜蘆醇補充飲食(RSV)8周，發(fā)現CR組心肌組織內SIRT3表達水平較對照組升高1倍以上(*p＜0.05)。此外，白藜蘆醇干預(RSV，1.8 mg·kg-1·day-1)可

14、以引起與CR作用類似的SIRT3表達水平升高。隨后，我們給予野生型小鼠組及SIRT3-/-小鼠組TAC術及假手術組處理（小鼠按不同進食方式進行喂養(yǎng)直至安樂死）。在實驗中我們觀察到SIRT3在TAC術后水平降低50％，而白藜蘆醇干預可維持小鼠心肌內SIRT3的表達水平。
　　2.白藜蘆醇抗心肌肥厚作用依賴于SIRT3參與
　　根據心重/體重比值測量，SIRT3-/-小鼠組在壓力超負荷刺激下產生更加嚴重的心肌肥厚（73％ in

15、SIRT3 KO+vehicle+TAC組;32％ in WT+vehicle+TAC組，*p＜0.05），白藜蘆醇干預可減輕野生型小鼠組心肌肥厚狀態(tài)，但在SIRT3-/-小鼠組未起到保護作用。白藜蘆醇干預可以降低其他心肌肥厚標志物水平，如ANP，Myh-7，但在SIRT3-/-小鼠組未能降低此類胎性基因表達，上述結果提示白藜蘆醇改善心肌肥厚作用依賴于SIRT3參與。
　　3.白藜蘆醇激活SIRT3可以改善心肌舒縮功能
　　

16、我們對小鼠進行超聲心動圖檢測，結果顯示在壓力超負荷刺激下，SI RT3-/-小鼠組左室后壁厚度較野生型小鼠組更加肥厚（1.45±0.07 mm，*p＜0.05）。左室短軸縮短率在TAC術后明顯降低，尤其在SIRT3-/-組，但左室射血分數在兩組間無明顯差別。在我們的實驗中我們發(fā)現壓力超負荷容易造成心臟舒張功能異常，其中Aa速度升高及Ea/Aa比值降低均提示舒張功能減低。在我們的研究中發(fā)現，SI RT3-/-小鼠組及野生型小鼠組在TAC術

17、后舒張功能均下降，尤其在SIRT3-/-小鼠中更為明顯。白藜蘆醇可以改善野生型小鼠組心臟舒張功能，但在SIRT3-/-小鼠組未起到明顯改善作用。上述研究證實白藜蘆醇激活SIRT3可以改善心肌功能，尤其是舒張功能。
　　結論:
　　1.SIRT3激活可抑制心肌纖維化及心臟功能減低
　　2.白藜蘆醇可升高小鼠心肌內SIRT3表達水平。
　　3.SIRT3的抗心肌纖維化作用依賴于對TGF-β/SMAD3通路的抑制作用。