共表達(dá)及染色體上表達(dá)折疊調(diào)節(jié)因子對外源蛋白功能性表達(dá)影響的研究.pdf

1、大腸桿菌在基因工程的研究中應(yīng)用極為廣泛,然而在表達(dá)外源蛋白時常遇到的問題是表達(dá)產(chǎn)物不能正確折疊,以沒有功能活性的包涵體形式存在,而包涵體的體外復(fù)性是一個困難而復(fù)雜的過程.因此提高外源蛋白在大腸桿菌中的功能性表達(dá)有很現(xiàn)實(shí)的意義.蛋白的折疊大多需要分子伴侶的協(xié)助才能完成,其中有兩類分子伴侶對蛋白的折疊有重要的影響.第一類是DnaK-DanJ,第二類是GroEL-GroES.對于含二硫鍵的蛋白,還需要Dsb家族分子的參與,才能形成正確的二硫鍵

2、.為觀察這些折疊調(diào)節(jié)因子對外源蛋白的功能性表達(dá)的影響,我們用PCR方法從大腸桿菌的染色體上分離了分子伴侶DnaK,DnaJ,GroEL和GroES的基因,以及Dsb家族分子中的DsbA和DsbC分子的基因,同時根據(jù)文獻(xiàn)報道,采用重疊延伸PCR方法構(gòu)建了DsbA和DsbC的兩個突變體基因,將上述基因分別克隆到表達(dá)載體上.以富含二硫鍵的尿激酶(UK)作為研究對象,來研究共表達(dá)及整合在染色體的折疊調(diào)節(jié)因子對富含二硫鍵的蛋白功能性表達(dá)的影響.尿

3、激酶的活性用纖維蛋白溶解試驗(yàn)測定.將篩選到的對UK的功能性表達(dá)有促進(jìn)作用的GroEL-S和DsbC基因,利用Red同源重組技術(shù),分別整合到大腸桿菌HB101的galK基因位置,將這兩個菌株命名為HB-G(galK::groEL-S)和HB-C(galK::dsbC).將UK在改造后的菌株中表達(dá),在整合了DsbC的HB-C菌株中觀察到了促進(jìn)UK功能性表達(dá)的作用,效果與UK在野生型的HB101中共表達(dá)DsbC相當(dāng);而整合了GroEL-S的菌

4、株HB-G則沒有明顯的促進(jìn)UK功能性表達(dá)的作用.將UK在HB-C中共表達(dá)GroEL-S,UK的功能性表達(dá)有了顯著的提高,是在野生型的HB101中共表達(dá)GroEL-S時的4倍,是共表達(dá)DsbC時的17倍.整合的DsbC與共表達(dá)的GroEL-S對UK的功能性表達(dá)顯示出了較強(qiáng)的協(xié)同作用.這表明,在HB-C中,整合在染色體上的DsbC對含二硫鍵的外源蛋白的功能性表達(dá)有促進(jìn)作用,與GroEL-S聯(lián)合作用效果更為明顯.而UK在整合了GroEL-S的