磁場(chǎng)三相流化床酶解殼聚糖的研究.pdf

1、低聚殼聚糖具有獨(dú)特的、優(yōu)越的生理活性和功能性質(zhì)，因而，在食品保健和生物醫(yī)藥領(lǐng)域中具有巨大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用潛力，發(fā)展前途廣闊。低聚殼聚糖可由殼聚糖通過(guò)酶降解方法制取。酶法具有環(huán)保、副產(chǎn)品少且可控性好等優(yōu)點(diǎn)，但普通酶法生產(chǎn)效率低、成本高，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。因此，尋求一種環(huán)保、生產(chǎn)成本低而產(chǎn)率高的方法對(duì)低聚殼聚糖生產(chǎn)的研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本研究以天然大分子殼聚糖在三相流化床磁生物反應(yīng)器進(jìn)行降解制取聚合度(DP)為4～16低聚殼聚糖為研究體

2、系，通過(guò)對(duì)磁性固定化纖維素酶的制備及其致磁敏學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)條件對(duì)殼聚糖降解產(chǎn)物影響的研究，了解殼聚糖的降解特性，優(yōu)化磁性固定化纖維素酶的制備工藝，揭示磁場(chǎng)條件下磁性固定化纖維素酶的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和殼聚糖降解為低聚糖的規(guī)律，探討磁場(chǎng)對(duì)酶降解殼聚糖的強(qiáng)化機(jī)理。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 一、磁性殼聚糖微球的制備及其表征以戊二醛為交聯(lián)劑、采用反相懸浮交聯(lián)技術(shù)合成了磁性殼聚糖微球。利用數(shù)碼光學(xué)顯微成像儀、激光粒度儀、傅立葉紅外光譜(FTIR)

3、、原子吸收分光光度計(jì)、磁天平和可調(diào)磁場(chǎng)現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)微球的形態(tài)、大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)及磁響應(yīng)性進(jìn)行了表征，結(jié)果表明，本研究合成磁性殼聚糖微球的平均粒徑為1251μm、內(nèi)部均勻分布著Fe3O4，具有良好的磁響應(yīng)性，在外磁場(chǎng)作用下，微球能夠快速沉降，為酶的固定化及其在磁場(chǎng)流化床的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。 二、磁性固定化纖維素酶的制備及其工藝優(yōu)化采用物理吸附法將纖維素酶固定在磁性殼聚糖微球上，用RSM分析法對(duì)制備磁性固定化纖維素酶的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)

4、化，得到了最優(yōu)工藝參數(shù)為：固定化時(shí)間12h、pH值5.2、離子濃度0.066：mol·L-1、酶用量202.7mL。最優(yōu)條件下得到的最大酶活力為28.5IU.g-1。通過(guò)考察不同溫度、不同pH下固定化酶酶活力的變化，得到最適溫度和pH分別為50℃和4.5。采用對(duì)照法比較了磁性固定化酶與游離酶在外加徑向磁場(chǎng)作用下的酶活力的變化，結(jié)果顯示：當(dāng)磁場(chǎng)作用時(shí)間＜60min時(shí)，游離酶和固定化酶的酶活隨著磁場(chǎng)作用時(shí)間的增加而增加，當(dāng)磁場(chǎng)作用時(shí)間超過(guò)6

5、0min，游離酶酶活快速下降，而固定化酶酶活僅略下降，表明制備的固定化酶酶活穩(wěn)定性較好。 三、磁場(chǎng)三相流化床反應(yīng)器中磁性固定化纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)以磁性固定化纖維素酶酶活力的變化為指標(biāo)，研究了磁場(chǎng)強(qiáng)度、磁場(chǎng)作用時(shí)間、溫度、表觀氣速和表觀液速對(duì)其活性的影響。結(jié)果表明：無(wú)論施加磁場(chǎng)與否，溫度均有助于促進(jìn)酶的活性；不同磁場(chǎng)的作用對(duì)酶活力的影響不同，以加載脈沖磁場(chǎng)效果最好；在一定磁場(chǎng)強(qiáng)度作用下，考察固定化酶酶活力的變化規(guī)律，找出在保持固定

6、化酶顆粒處于流態(tài)化下殼聚糖酶解效果最佳Ug和U1分別為50 mL/min和20 mL/min。采用RSM響應(yīng)面分析法和二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得出流化床最優(yōu)操作參數(shù)為： Ug、U1、H和磁場(chǎng)作用時(shí)間t分別為55.1 mL/min、23.1 mL/min、1.7 kA/m、26min。 四、磁場(chǎng)三相流化床的研制及其流動(dòng)特性的研究以電磁學(xué)理論和流態(tài)化理論為基礎(chǔ)研制出磁場(chǎng)三相流化床酶反應(yīng)器，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)恒、交變和脈沖三種磁場(chǎng)的轉(zhuǎn)換?？?/p>

7、察磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)床層特性的結(jié)果顯示：當(dāng)H＜0.5KA/m時(shí)，床層表現(xiàn)為散流區(qū)；當(dāng)0.5kA/m＜H＜7.5kA/m時(shí)，床層處于鏈流區(qū)；當(dāng)H＞7.5KA/m時(shí)，床層處于磁聚區(qū)；考察了磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)三相流化床起始流動(dòng)狀態(tài)的影響，結(jié)果表明，一定范圍內(nèi)，Ugmf和Ugmf隨H的增大而增大。 五、磁場(chǎng)三相流化床條件下磁性固定化纖維素酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究采用Lineweaver-Burk方法，研究了以濃度為1～5mg/mL的大分子殼聚糖為底物，磁性固

8、定化纖維素酶酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示：穩(wěn)恒、交變和脈沖三種磁場(chǎng)作用下，Km值隨磁場(chǎng)強(qiáng)度的增加而增加，表明酶對(duì)殼聚糖底物的親和力下降；應(yīng)用雙膜模型Sh=2.0+0.6dpuPL/μL1/2.μL/PLD1/3=KL.Pd/D理論，初步探討了酶反映動(dòng)力學(xué)的變化機(jī)理。以濃度為5～25mg/mL的殼聚糖為底物，固定化酶反應(yīng)速率與底物濃度的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，一定底物濃度范圍內(nèi)，一定表觀氣速和液速條件下，磁場(chǎng)的施加可以提高酶反應(yīng)速率；而且發(fā)現(xiàn)在H=

9、1.5kA/m的相同磁場(chǎng)強(qiáng)度下，以脈沖磁場(chǎng)處理?xiàng)l件下的反應(yīng)速率最大。 六、磁場(chǎng)三相流化床條件下殼聚糖的降解特性及其機(jī)理探討采用LVD-I+型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)研究了初始底物濃度、表觀氣速、磁場(chǎng)形式對(duì)殼聚糖反應(yīng)液粘度的影響。結(jié)果表明，固定化纖維素酶是通過(guò)內(nèi)切方式作用于殼聚糖分子的β-1,4-糖苷鍵，使其分子鏈斷裂，降解為低分子量物質(zhì)。 采用HPLC法對(duì)DP＜8的殼聚糖水解產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果顯示，在H=1.5kA/m磁場(chǎng)作用

10、下，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為150min時(shí)，五聚糖和六聚糖的總含量最高，且脈沖磁場(chǎng)作用下的殼聚糖降解產(chǎn)率是對(duì)照樣品的1.5倍，表明施加磁場(chǎng)有利于促進(jìn)酶解反應(yīng)；并應(yīng)用達(dá)姆科勒準(zhǔn)數(shù)(Da)探討了殼聚糖降解的機(jī)理，指出在實(shí)際中如果控制通過(guò)適當(dāng)控制，創(chuàng)造Da值較大的條件，則有可能得到較高C(5+6)。 應(yīng)用FTIR和X-Ray現(xiàn)代方法對(duì)8＜DP＜16的低聚殼聚糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，F(xiàn)TIR．圖結(jié)果說(shuō)明，殼聚糖酶降解前后，其分子基本結(jié)構(gòu)并沒(méi)有改變，只是