不同寄主中RBSDV基因組表達分析及RBSDV P7-1互作寄主因子篩選.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)通過灰飛虱（Laodelphax striatellus）以持久性方式傳播，為水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病等的病原。RBSDV基因組由10條dsRNA組成，含有13個開放閱讀框(Open readingframe，ORF)。RBSDV可侵染水稻、玉米和小麥等植物引起矮縮、葉色深綠等癥狀。目前，RBSDV在不同植物寄主中的表達是否存在差異以及RBS

2、DV在植物寄主與介體昆蟲中的表達是否存在差異均不清楚。本研究利用quantitativereal-time PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析了RBSDV基因組編碼的13個基因在水稻、玉米、小麥和介體灰飛虱中的表達。結(jié)果顯示，在水稻、玉米和小麥中P7-1和P10基因相對表達量較高，而P7-2和P8基因相對表達量則較低;在灰飛虱中P7-1相對表達量最高，P8基因相對表達量則最低，表明RBSDV在植物和介體昆蟲中的表達模式具有相似性。P7-1

3、在植物和介體灰飛虱中的表達量均較高，可作為病毒檢測的靶基因。P5-1、P6和P9-1為RBSDV病毒基質(zhì)組分，其在不同寄主中的表達量不同，病毒有可能通過調(diào)整病毒復(fù)制相關(guān)的病毒基質(zhì)基因的表達而在不同寄主體內(nèi)復(fù)制。RBSDV侵染水稻后致使其內(nèi)源激素ABA含量升高，且對8d～24d的RBSDV基因組實時表達分析表明，P7-1在侵染后8d～24d均為較高表達量，在侵染8d時基因表達量顯著高于其他病毒基因的表達。P7-1在不同寄主中的高表達水平表

4、明其在RBSDV與寄主的相互作用中起著重要作用，而那些在不同寄主中的差異表達的病毒基因可能參與病毒與寄主的特異性互作。
　　已有研究表明RBSDV P7-1定位于植物的胞間連絲，在植物和介體昆蟲中可形成管狀結(jié)構(gòu)，可能參與病毒的細(xì)胞間運動。P7-1還是一個致病因子，在擬南芥中過量表達P7-1蛋白導(dǎo)致植物不育。此外，我們對病毒在不同寄主中的表達量分析表明，P7-1在植物和介體昆蟲中的表達量均很高。為分析RBSDV P7-1與灰飛虱的互

5、作機制，本研究以P7-1為誘餌篩選了灰飛虱cDNA文庫。首先通過RT-PCR擴增獲取RBSDV P7-1基因序列，然后構(gòu)建酵母雙雜交誘餌表達載體pGBKT7-P7-1，通過順序轉(zhuǎn)化方法篩選灰飛虱cDNA酵母文庫，篩選獲得陽性克隆的cDNA插入片段大小通過PCR進行分析，將PCR產(chǎn)物大小大于500bp的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進行測序，序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析。測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，篩到的陽性克隆分別編碼15種不同的互作蛋

6、白，包括ATP酶B亞基、40S核糖體蛋白、烯醇化酶、羧酸酯酶和蛋白磷酸酶等。研究結(jié)果為進一步分析病毒與介體互作機制奠定了基礎(chǔ)。
　　為分析P7-1與植物的互作關(guān)系，本研究構(gòu)建了水稻cDNA文庫，并以RBSDVP7-1為誘餌篩選了水稻中的互作因子。水稻cDNA文庫的構(gòu)建以日本晴(Nipponbare)為材料，通過同源重組技術(shù)制備三框型cDNA入門文庫，再通過gateway技術(shù)將入門文庫轉(zhuǎn)移到雜交載體pGADT7-DEST上，構(gòu)建了水

7、稻酵母雙雜交cDNA文庫。檢測結(jié)果表明，文庫容量為1.3×107cfu，擴增文庫滴度為4.34×109cfu/mL，重組率為大于95％，cDNA插入片段平均長度大于1kb，均達到標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫的要求。以P7-1蛋白為誘餌篩選水稻cDNA文庫，獲得28個陽性克隆。經(jīng)序列分析后，共獲得11種在酵母中與P7-1互作的水稻因子，包括半胱氨酸蛋白酶合成前體、超氧化物歧化酶、蛋白酶抑制子、Myb轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子IIH亞基和過氧化氫酶等。研究結(jié)果