β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌三孢布拉霉的選育及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、β-胡蘿卜素是一類重要的類胡蘿卜素，在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域和化妝品領(lǐng)域等方面具有廣泛應(yīng)用。β-胡蘿卜具有順式和全反式兩種異構(gòu)體，研究表明，順式異構(gòu)體的β-胡蘿卜素具有更高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗心血管疾病等功能，該異構(gòu)體主要來(lái)源于天然β胡蘿卜素，而非人工合成。利用三孢布拉霉菌株發(fā)酵是生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的主要途徑之一，但仍存在產(chǎn)量不高、菌種穩(wěn)定性較差等關(guān)鍵問(wèn)題。因此，選育三孢布拉霉穩(wěn)定高產(chǎn)β-胡蘿卜素菌株成為研究重點(diǎn)。為此，本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的三孢布

2、拉霉（Blakeslea trispora）為出發(fā)菌株，通過(guò)建立絲狀真菌分離單菌落方法以及高產(chǎn)β-胡蘿卜素的三孢布拉霉菌株高通量篩選方法，并結(jié)合三孢布拉霉誘變選育技術(shù)，以期選育獲得高產(chǎn)菌株，并通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化，提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量，取得的主要研究結(jié)果如下：
　?。?）建立了一種絲狀真菌分離單菌落方法，可有效解決絲狀真菌平板分純篩選難題。本研究獲得一種絲狀真菌篩選劑烯草酮，在烯草酮與PDA固體培養(yǎng)基體積比為0.01％-0.04%時(shí)，

3、可使三孢布拉霉形成明顯單菌落，更好的防止菌株退化，保證菌株性能的穩(wěn)定性且該三孢布拉霉單菌落發(fā)酵β-胡蘿卜素性能也得到明顯提高，而烯草酮濃度進(jìn)一步提高則會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)。本技術(shù)在產(chǎn)油脂絲狀真菌被孢霉(Mortierella)、模式真菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)也可以很好的推廣應(yīng)用。
　?。?）建立了三孢布拉霉高通量篩選方法，并成功選育獲得β-胡蘿卜素高產(chǎn)突變株。首先，建立了利用OD值快速檢測(cè)孢子數(shù)量的方法，以

4、及利用洛伐他汀定向篩選三孢布拉霉的方法，通過(guò)理化誘變篩選獲得高產(chǎn)孢能力的負(fù)菌，使其產(chǎn)孢量較出發(fā)菌株提高了4.87倍；其次，結(jié)合TTC染色，確定了96深孔板高通量篩選高產(chǎn)β-胡蘿卜素突變株的最佳條件：即，在三孢布拉霉發(fā)酵時(shí)間2天后，用1.2%TTC染色8h，二甲基亞砜振蕩萃取1.5h，萃取液在酶標(biāo)儀上485nm下檢測(cè)菌體TTC染色程度，根據(jù)β-胡蘿卜素產(chǎn)量與TTC染色程度成正比篩選，利用上述篩選技術(shù)，獲得β-胡蘿卜素高產(chǎn)突變菌株Blake

5、slea trispora XL2（-），β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高為1.34±0.06g/L，相對(duì)于原始出發(fā)菌株Blakeslea trispora（-）提高了121.9倍。對(duì)菌株Blakeslea trispora XL2（-）連續(xù)6次傳代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，Blakeslea trispora XL2（-）可穩(wěn)定遺傳。實(shí)時(shí)熒光定量分析了β-胡蘿卜素代謝途徑中的5個(gè)關(guān)鍵酶基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)突變株XL2中carG，carB和carRA

6、顯著提高，強(qiáng)化了β-胡蘿卜素的代謝流，提高了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。
　　（3）優(yōu)化了β-胡蘿卜素發(fā)酵條件。首先，確定了單因素優(yōu)化的發(fā)酵條件：裝液量50mL/250mL，三孢布拉霉突變株XL2（-）和正菌先接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)再混合發(fā)酵；其次，通過(guò)響應(yīng)面分析，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：大豆油20，玉米漿干粉13.96，磷酸二氫鉀3.17，玉米粉40，葡萄糖10，黃豆粉30，硫酸鎂1，Span202，BHT4，VB10.0001。最后，