幾類重要的酶催化反應(yīng)的機(jī)理研究.pdf

1、酶是具有催化功能的特殊蛋白質(zhì)，有生物催化劑之稱。根據(jù)專一性的不同，可以分為六大類:氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構(gòu)酶類和連接酶類。隨著生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，酶催化反應(yīng)越來越多地被科學(xué)家們應(yīng)用到我們生活的各個(gè)方面。雖然目前已有實(shí)驗(yàn)方法可以得到酶的晶體結(jié)構(gòu)、催化活性、激活劑和抑制劑等信息，但是整個(gè)反應(yīng)過程的詳細(xì)信息仍然無法確定。近年來，隨著量子化學(xué)理論及方法的不斷完善，計(jì)算機(jī)運(yùn)行速度的提高，計(jì)算化學(xué)對酶催化領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，

2、成為化學(xué)工作者必不可少的強(qiáng)有力的理論工具。
　　 本論文以幾種重要的酶催化反應(yīng)為研究對象，綜合運(yùn)用量子化學(xué)、分子力學(xué)以及兩者相結(jié)合的方法對其催化機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的理論研究，獲得了其反應(yīng)過程的詳細(xì)信息，揭示了其催化反應(yīng)的本質(zhì)，解釋了有關(guān)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并補(bǔ)充了相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，促進(jìn)了生命大分子體系計(jì)算方法的發(fā)展和應(yīng)用研究。
　　 本論文主要工作描述如下:
　　 (1)異構(gòu)酶——苯丙氨酸氨基變位酶的催化機(jī)理研究
　　 苯丙氨

3、酸氨基變位酶（TcPAM）催化(2S)-α-苯丙氨酸異構(gòu)化生成(3R)-β-苯丙氨酸，是著名的抗癌藥紫杉醇的13位側(cè)鏈合成的第一步反應(yīng)，該酶是在植物中首次發(fā)現(xiàn)的氨基變位酶，并且是目前在生物體內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的唯一的苯丙氨酸氨基變位酶。在TcPAM活性口袋中，存在特殊的親電試劑4-亞甲基-1H-咪唑-5(4H)-酮(MIO)，MIO結(jié)構(gòu)是Ala-Ser-Gly通過自身催化而形成的。目前針對MIO-依賴氨基變位酶提出的反應(yīng)機(jī)理有兩種:米切爾加成反應(yīng)

4、和傅氏反應(yīng)。我們應(yīng)用密度泛函理論B3LYP方法研究了苯丙氨酸氨基變位酶的催化機(jī)理。計(jì)算結(jié)果表明:此反應(yīng)經(jīng)歷了米切爾加成反應(yīng)機(jī)理，而不是傅氏反應(yīng)機(jī)理。在米切爾加成反應(yīng)機(jī)理中，Cβ脫氫過程為整個(gè)過程的決速步，Cβ脫氫和氨解離過程經(jīng)歷了E1cB機(jī)理;中間體肉桂酸發(fā)生了分子內(nèi)C1-Cα的旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致了產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)與SgTAM催化產(chǎn)物不同;活性中心關(guān)鍵殘基對底物的結(jié)合和催化起到十分重要的作用。我們得到的計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，描述了整個(gè)催化反應(yīng)的

5、細(xì)節(jié)，解釋了立體化學(xué)效應(yīng)，有助于生物合成前體的制備及抗癌藥物的設(shè)計(jì)和研發(fā)。
　　 (2)水解酶——多聚腺苷二磷酸核糖水解酶和檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物水解酶的催化機(jī)理研究
　　 聚腺苷二磷酸核糖化(PAR化)是一種短暫的、動(dòng)態(tài)的、可逆的對核蛋白翻譯后的修飾過程，參與了多方面的生理過程:DNA損傷后修復(fù)和基因組整體性的維系，對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，對蛋白質(zhì)降解的調(diào)節(jié)，以及細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞的死亡等。在這個(gè)過程中，聚（腺苷二磷酸核糖）聚

6、合酶(PARP)和聚（腺苷二磷酸核糖）水解酶（PARG）具有重要的調(diào)節(jié)作用。PARG是唯一的降解腺苷二磷酸核糖聚合物的酶。PARG通過催化α(1”-2')和(1”'-2”)核糖基-核糖水解PAR得到構(gòu)型翻轉(zhuǎn)的ADP-核糖。我們通過利用密度泛函B3LYP方法研究了聚（腺苷二磷酸核糖）水解酶(PARG)催化聚（腺苷二磷酸核糖）(PAR)的降解機(jī)理?；谧钚碌玫降木w結(jié)構(gòu)，我們構(gòu)建了三個(gè)不同大小的活性口袋模型，以期得到PARG的催化水解機(jī)理，

7、以及關(guān)鍵殘基的作用。計(jì)算結(jié)果證明，PARG催化PAR的水解反應(yīng)經(jīng)歷了SN2的機(jī)理而不是實(shí)驗(yàn)猜測的SNI機(jī)理。通過不同模型的計(jì)算，我們得到了關(guān)鍵殘基的作用。文中得到的核糖-核糖之間糖苷鍵的水解機(jī)理，可以為后續(xù)突變實(shí)驗(yàn)、抑制劑實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 環(huán)氧化合物水解酶(EHs)，是一組催化環(huán)氧化合物水解為相應(yīng)鄰二醇的酶類。EHs含有高度相似的氨基酸序列，屬于α/β折疊型水解酶系。但是檸檬烯-1，2-環(huán)氧化物水解酶(LEH)不具備

8、α/β折疊結(jié)構(gòu)，有著不同于一般水解酶的結(jié)構(gòu)以及催化機(jī)理。最新的實(shí)驗(yàn)報(bào)道通過突變特定殘基可以改變底物的選擇性，這些突變體可以應(yīng)用到生物有機(jī)合成中。我們通過量子力學(xué)和分子力學(xué)相結(jié)合的方法（QM/MM方法）研究了LEH催化環(huán)氧化物的水解反應(yīng)機(jī)理。結(jié)果表明，檸檬烯環(huán)氧化物水解酶具有不同于一般水解酶的結(jié)構(gòu)以及催化機(jī)理，是酸催化的單步協(xié)同反應(yīng)機(jī)理，其活性中心為Asp101-Arg99-Asp132形成的三位一體結(jié)構(gòu)，其催化機(jī)制為:Asp101為環(huán)氧

9、化物的提供質(zhì)子;Asp132吸引水分子中的質(zhì)子，輔助羥基親核進(jìn)攻取代基多的環(huán)氧碳，導(dǎo)致環(huán)氧化物開環(huán)。殘基Tyr53、Asn55、Asp132與水分子形成氫鍵，使其處于最有利于親核進(jìn)攻的位置;殘基Arg99雖然沒有直接參與催化反應(yīng)，但是起到定位兩個(gè)天冬氨酸的羧基，穩(wěn)定電荷的重要作用。
　　 (3)氧化還原酶——丙酮酸脫羧酶的催化機(jī)理研究
　　 丙酮酸脫羧酶(PDC)是一種最簡單的ThDP依賴脫羧酶，催化α-酮基羧酸脫羧，進(jìn)

10、而與醛類發(fā)生縮合反應(yīng)，生成α-羥基酮類化合物。PDC參與生物體內(nèi)的多種合成與分解代謝過程，是許多藥物的作用靶點(diǎn)，在有機(jī)合成、藥物中間體合成、手型催化等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。例如，維生素E、抗真菌藥Sch42427、麻黃堿等化合物的合成都是以α-羥基酮類化合物為中間體。雖然實(shí)驗(yàn)和理論上對PDC催化過程都有大量的研究，但是到目前為止，對于其催化細(xì)節(jié)尚沒有比較一致的結(jié)論。我們采用QM/MM方法研究了丙酮酸脫羧酶(PDC)催化丙酮酸生成乙醛的

11、反應(yīng)。通過設(shè)計(jì)關(guān)鍵殘基的不同質(zhì)子化狀態(tài)，我們構(gòu)建了三個(gè)計(jì)算模型，得到了不同反應(yīng)路徑的結(jié)構(gòu)和能量信息等。計(jì)算結(jié)果表明，只有當(dāng)Asp27'、His113'、His114'都處于質(zhì)子化的狀態(tài)時(shí)，該催化反應(yīng)最容易進(jìn)行，脫羧過程是整個(gè)反應(yīng)的決速步。我們的計(jì)算結(jié)果不僅解釋了實(shí)驗(yàn)事實(shí)，而且為設(shè)計(jì)新型PDC抑制劑提供了理論依據(jù)。
　　 (4)轉(zhuǎn)移酶——O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和苯乙胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的催化機(jī)理研究
　　 O6-

12、甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(AGT/MGMT)是承擔(dān)DNA損傷直接修復(fù)的最重要的酶，可同時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)移酶和甲基受體的作用，保護(hù)細(xì)胞免受烷化劑損害，防止細(xì)胞癌變和死亡。它將甲基從O6-mG轉(zhuǎn)移到自身的自身的半胱氨酸殘基(Cys145)上，使DNA鏈上的鳥嘌呤復(fù)原，同時(shí)自身不可逆的失活。本章采用QM/MM方法研究了人類修復(fù)酶O6-氧-甲基嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(AGT)的催化反應(yīng)機(jī)理。通過計(jì)算，我們得到了該反應(yīng)的反應(yīng)路徑，反應(yīng)勢壘，并且得出結(jié)

13、論:該反應(yīng)中甲基轉(zhuǎn)移過程是甲基正離子的轉(zhuǎn)移，其決速步是甲基正離子的生成過程。殘基Glu172，Ser159和Tyr114起到穩(wěn)定過渡態(tài)降低能壘的作用。值得注意的是，本章采用的QM/MM方法更能體現(xiàn)蛋白質(zhì)環(huán)境對反應(yīng)機(jī)理有重要的影響，彌補(bǔ)了之前QM方法計(jì)算的不足。
　　 腎上腺素(EPI)是在人體在應(yīng)激狀態(tài)下由腎上腺髓質(zhì)分泌的一種兒茶酚胺激素。它可以通過作用于α、β型腎上腺能受體，在體內(nèi)產(chǎn)生變化，使心臟收縮力上升、興奮性增高、收縮或

14、舒張血管、調(diào)節(jié)血壓、擴(kuò)張氣管、提高機(jī)體代謝等等。腎上腺素是酪氨酸在不同種類的酶催化下經(jīng)歷不同的中間體而生成的。在最后一步反應(yīng)中，苯乙胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PNMT)在輔酶甲硫氨酸(AdoMet)的作用下催化去腎上腺素(NE)生成腎上腺素(EPI)。研究表明，這是合成腎上腺素唯一的反應(yīng)路徑。因此研究PNMT催化機(jī)理對PNMT的基礎(chǔ)研究以及新型腎上腺素抑制劑的研究都是非常有意義的。本章通過QM/MM方法研究了PNMT催化反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理。整個(gè)反

15、應(yīng)過程包括三個(gè)基元反應(yīng)，其中甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)是決速步，經(jīng)歷了SN2反應(yīng)機(jī)理，能壘為16.4kcal/mol?；钚钥诖械臍埢鵊lu219、Glu185、Tyr35，以及兩個(gè)水分子對催化反應(yīng)都有非常重要的作用。尤其是Glu219和Glu185都參與反應(yīng)，但是發(fā)揮了不同的作用:Glu185在第一步質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)中作為質(zhì)子受體接收一個(gè)質(zhì)子;Glu219，在最后一步反應(yīng)中，從質(zhì)子化的EPI上得到一個(gè)質(zhì)子，從而生成最終產(chǎn)物。所以，這兩個(gè)殘基都可以作為改

16、變PNMT催化速率的目標(biāo)殘基。
　　 (5)新型雙功能酶—1，6-二磷酸果糖醛縮酶/磷酸酶的催化機(jī)理研究
　　 古細(xì)菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶/磷酸酶(FBPA/P)，是一種新型雙功能酶，這種酶只包含一個(gè)活性中心，但是催化兩種不同的糖異生反應(yīng)，包括二羥基丙酮磷酸(DHAP)和3-磷酸甘油醛(GA3P)可逆的羥醛縮合反應(yīng)，生成1，6-二磷酸果糖(FBP)，以及二磷酸果糖不可逆的脫磷酸反應(yīng)，生成6-磷酸果糖(F6P)。直到最

17、近，人們才發(fā)現(xiàn)了其醛縮酶的功能，并得到了其在這種功能狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)，而在這之前，F(xiàn)BPA/P被歸類為Ⅴ型果糖雙磷酸酶。對于FBPA/P新發(fā)現(xiàn)的醛縮酶功能，尚沒有詳細(xì)的理論研究。本章采用QM/MM方法，基于最新得到的晶體結(jié)構(gòu)，研究了雙功能酶FBPA/P的醛縮合反應(yīng)機(jī)理。計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)一致，在反應(yīng)過程中經(jīng)歷了希夫堿的中間體。整個(gè)反應(yīng)的決速步是FBP的C3-C4成鍵的過程，其自由能壘為24.7kcal/mol。Lys232和Tyr229直接