AtST39和AtST39H在鹽脅迫干旱脅迫中的功能研究.pdf

1、高鹽、干旱和凍害等非生物脅迫給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的影響，造成農(nóng)作物大幅度減產(chǎn)。因此，研究植物的抗逆機(jī)制、分離篩選抗逆相關(guān)基因越來越受到重視。擬南芥是植物界的模式生物，作為研究材料具有其獨(dú)特的優(yōu)勢。研究擬南芥的抗逆途徑對研究農(nóng)作物的抗逆途徑有重要指導(dǎo)意義。本課題組前期研究推測擬南芥DUF966基因家族的兩個基因AtST39(At3g46110)和AtST39H(At5g59790)參與了植物的抗逆途徑，可能是兩個抗逆基因。本研究對AtST

2、39和AtST39H的功能進(jìn)行了深入的探究。
　　融合GFP轉(zhuǎn)基因植株顯示AtST39蛋白可能定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。啟動子融合GUS的轉(zhuǎn)基因植株在幼苗的根、莖、葉和成熟期葉脈、花藥、柱頭及莖的切口處中檢測到GUS活性。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)AtST39基因受到NaCl、低溫和干旱等脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，特別是在NaCl脅迫下表達(dá)量上調(diào)明顯。主要研究了鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因植株幼苗期主根生長發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，干擾轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫更敏感:鹽處

3、理下，干擾轉(zhuǎn)基因植株的主根長度明顯比野生型短很多;對根尖顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)野生型植株經(jīng)脅迫后根尖膨大，而干擾轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)脅迫后根尖極度變窄（未經(jīng)脅迫時干擾轉(zhuǎn)基因植株的根尖就已經(jīng)膨大）;未經(jīng)脅迫時干擾轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的CAT活性比野生型植株高將近5倍。并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成熟期時過量轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、耐干旱能力比野生型強(qiáng)，突變體及干擾轉(zhuǎn)基因植株比野生型要弱。結(jié)果說明AtST39基因參與了擬南芥的抗鹽、抗干旱途徑，并且起到了正調(diào)控作用。
　　qRT

4、-PCR分析相關(guān)防御基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn):干擾轉(zhuǎn)基因植株的逆境應(yīng)答基因RD29A、RD29B、RD22、RAB、ERD1、COR15都上調(diào)明顯，生長素轉(zhuǎn)錄激活因子ARF5、生長素合成酶相關(guān)基因YUC1、YUC4明顯上調(diào)，說明干擾轉(zhuǎn)基因植株中生長素信號途徑被激活。與生長素響應(yīng)啟動子DR5∷GUS植株雜交檢測內(nèi)源生長素分布，發(fā)現(xiàn)過量轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株經(jīng)NaCl處理后，內(nèi)源生長素含量升高，并且隨時間的延長而升高;突變體、干擾轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)NaC

5、l處理后，內(nèi)源生長素含量升高，但是隨時間的延長含量降低。上述結(jié)果表明AtST39基因可能參與或影響了生長素信號途徑。
　　融合GFP轉(zhuǎn)基因植株顯示AtST39H蛋白可能定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。啟動子融合GUS的轉(zhuǎn)基因植株在幼苗的葉和成熟期花柱和萼片檢測到GUS活性。AtST39H基因的表達(dá)同樣受到NaCl的誘導(dǎo)表達(dá)。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AtST39H突變體5-5的耐鹽、耐干旱能力與野生型植株沒有區(qū)別。qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株逆境應(yīng)答基

6、因的表達(dá)發(fā)現(xiàn):突變體5-5的逆境應(yīng)答基因基本都下調(diào)表達(dá)，但RD22、ERD1、PAD3上調(diào)明顯。5-5中的的生長素合成酶相關(guān)基因中YUC1、YUC4明顯下調(diào)。構(gòu)建了His-AtST39H和GST-AtST39H原核表達(dá)載體，蛋白純化后得到了較高濃度的AtST39H蛋白，以便進(jìn)一步獲得相應(yīng)抗體，從蛋白水平對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定。
　　雜交獲得AtST39和AtST39H的雙突變體在正常生長條件下表型與野生型沒有差別。qRT-PCR分析