人卵巢癌細胞SKOV3中側(cè)群細胞的分離和特性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　上皮性卵巢癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，發(fā)病機理不明，其占卵巢惡性腫瘤的85-90％，5年生存率約30%左右。通過滿意的腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療可使卵巢癌患者的預(yù)后明顯改善，但5年的復(fù)發(fā)率仍高達70%，且復(fù)發(fā)的卵巢癌往往出現(xiàn)耐藥性而治療效果較差。既往研究顯示腫瘤干細胞（CSCs）可能是導(dǎo)致如此高復(fù)發(fā)率的一個潛在原因。機體干細胞具有自我更新及多向分化的能力，此外其在正常組織中常處于休眠狀態(tài)，在機體需要時重新進入細

2、胞周期增殖替代細胞或組織修復(fù)。CSCs是指實體腫瘤內(nèi)部少量具有自我更新能力、能生長出含有異質(zhì)性細胞群的細胞。因此對CSCs的研究具有重要意義，分離和鑒定是CSCs研究的第一步，但CSCs缺乏統(tǒng)一的特異性標記，故分離和鑒定成為難點，國外部分學(xué)者通過采用流式細胞分選術(shù)在卵巢癌細胞中檢測分選出側(cè)群細胞（SP細胞）及非側(cè)群細胞（NSP細胞），研究其干細胞屬性，發(fā)現(xiàn)SP細胞能產(chǎn)生SP、NSP子代細胞，其與NSP細胞相比具有較強致瘤能力和耐藥性，進

3、一步研究發(fā)現(xiàn)該類細胞高表達CD44，nestin，ABCG2等具有一定特異性干細胞分子。
　　雖然規(guī)范化外科手術(shù)聯(lián)合放化療對治療卵巢癌具有較好的效果，但針對腫瘤復(fù)發(fā)及化療不敏感的患者依然需要探索進一步的治療方法。故針對腫瘤標志物及信號通路的分子靶向技術(shù)逐漸成為研究熱點。許多研究已證實各種實體瘤當(dāng)中存在著腫瘤干細胞，探索上皮性卵巢癌細胞表面干細胞標志物的表達情況將對未來的治療研究具有積極意義。
　　方法：
　　將卵巢癌細

4、胞株SKOV-3培養(yǎng)傳代后，胰酶消化成單細胞懸液，經(jīng)Hoechst33342熒光染料處理后使用流式細胞儀根據(jù)細胞的不同染色情況區(qū)分出 SP細胞和non-SP細胞，并觀察研究順鉑（CDDP）對SP及non-SP細胞細胞周期及細胞活力的影響。
　　具體實驗步驟如下：
　　1，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測SP及non-SP細胞中CD44蛋白的表達量。
　　2，采用Real-time PCR方法分析SP及non-SP細胞中ABCG2和N

5、estin的mRNA表達情況。
　　3，采用平板克隆形成實驗檢測SP及non-SP細胞體外克隆形成能力。
　　4，分析CDDP對SP及non-SP細胞細胞周期及細胞活力的影響。
　　5，計量資料用means±SEM（均數(shù)加減標準誤）描述，經(jīng)SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理，采用方差分析，當(dāng)P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)P>0.05時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。每組結(jié)果均檢驗3次
　　結(jié)果：
　　1，CD44標記

6、的SP和non-SP細胞MFI值顯著升高，并且SP細胞的MFI值更高于non-SP細胞，提示SP細胞的CD44抗原表達更為活躍(P<0.05)。
　　2，SP和non-SP細胞中ABCG2和Nestin的相關(guān)mRNA的表達結(jié)果提示分選的SP細胞中ABCG2和Nestin的表達顯著高于non-SP細胞(P<0.05)。
　　3，體外克隆形成能力實驗提示SP細胞的克隆形成能力遠強于non-SP細胞，該結(jié)果提示SP細胞擁有更活躍的

7、增殖能力。
　　4，CDDP處理試驗組中，SP細胞比non-SP細胞表現(xiàn)出更高的細胞活性，提示SP細胞對化療藥物具有更強的抗藥性。
　　結(jié)論：
　　腫瘤干細胞標志物CD44及腫瘤干細胞相關(guān)基因（ABCG2和Nestin）的高表達，均證實SKOV3細胞中分離出SP細胞具有腫瘤干細胞的特征。分離出的SP細胞在腫瘤細胞克隆形成能力實驗中也表現(xiàn)出較強的再生和增殖能力。另外，通過觀察順鉑對SP細胞細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)SP細胞對化