液態(tài)納米組織工程骨對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性股骨頭缺血性壞死修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：股骨頭壞死在骨科領(lǐng)域?qū)儆诙嘁姴?、常見病，?duì)髖關(guān)節(jié)具有非常大的破壞性和退行性改變，致殘率高和病程長(zhǎng)是其特點(diǎn)，對(duì)人民的健康危害嚴(yán)重。股骨頭壞死治療不當(dāng)，約80％的患者在1～4年內(nèi)可出現(xiàn)股骨頭塌陷。一旦股骨頭出現(xiàn)塌陷，患者的髖關(guān)節(jié)功能就意味著毀損。因此治療的主要目的是防止股骨頭塌陷，保存自體股骨頭。由于股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制還未完全明確，因此對(duì)股骨頭壞死的治療尚無(wú)有效的方法。目前有很多保髖手術(shù)方法，如帶血管蒂的腓骨移植、髓芯減壓、表面置換

2、、血管束植入等，均取得一定的治療效果，但沒有一種技術(shù)是非常滿意的。近年來有研究表明納米羥基磷灰石/膠原(nano2hydroxyapatite/collagen，nHAC)的成分和微結(jié)構(gòu)與天然骨非常相似，礦物相是含有碳酸根的羥基磷灰石，晶粒尺寸在納米量級(jí)，結(jié)晶度低，礦物和Ⅰ型膠原蛋白基質(zhì)均勻混合。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植可誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞早已在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。在動(dòng)物模型上采用干細(xì)胞移植治療股骨頭壞死，亦取得良好效果。

3、本實(shí)驗(yàn)試圖用液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)修復(fù)股骨頭骨缺損，以研究其對(duì)股骨頭壞死區(qū)修復(fù)的效果，探索用液態(tài)納米組織工程骨治療股骨頭壞死的新領(lǐng)域。
　　方法：1.實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組：在做實(shí)驗(yàn)前一周飼養(yǎng)好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如果有疾病則淘汰，如果健康則做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，手術(shù)前一天給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食水。選好之24只成年新西蘭大白兔，隨機(jī)分為A、B兩組，每組12只，A組為液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)移植組，B組為BM

4、SCs聯(lián)合自體松質(zhì)骨移植組。術(shù)后2，4，6，8周A、B兩組分別處死3只新西蘭大白兔。2.BMSCs的取得、培育及混合載體：做實(shí)驗(yàn)前1周從新西蘭大白兔髂后上嵴處抽取骨髓，把骨髓液種植于選好之6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，板內(nèi)培養(yǎng)液為20％胎牛血清DMEM液，培養(yǎng)板置入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，以密度為1×106/cm2傳代，傳至第3代。第3代細(xì)胞培養(yǎng)至傳代密度時(shí)制成細(xì)胞懸液，A組種植在準(zhǔn)備好的納米材料(nHAC)上，制備成組織工程骨，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，

5、待手術(shù)時(shí)植入被實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭壞死區(qū)。B組與明膠海綿顆?；旌?，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，手術(shù)時(shí)將BMSCs和明膠海綿混合物及自體松質(zhì)骨顆粒一并植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭壞死區(qū)。3.制備動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)方法：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的兩側(cè)股骨頭都做實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采取俯臥位，麻醉藥選硫噴妥鈉注射液，麻醉時(shí)按40mg/kg的硫噴妥鈉注入腹腔內(nèi)。麻醉成功后消毒、鋪無(wú)菌巾單。取雙側(cè)髖關(guān)節(jié)后側(cè)入路，暴露雙側(cè)股骨頭，把液氮棉團(tuán)溥于股骨頭處連續(xù)冷凍3分鐘，股骨頭壞死模型即制

6、成。自然復(fù)溫后用直徑3.5mm鉆頭從股骨頸內(nèi)后側(cè)向股骨頭內(nèi)鉆孔，鉆入深度為4mm，不穿過關(guān)節(jié)軟骨。A組鉆孔后在壞死模型壞死區(qū)植入液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)，逐層縫合切口。B組鉆孔后在壞死模型壞死區(qū)植入BMSCs+明膠海綿顆粒+自體松質(zhì)骨顆粒，逐層縫合切口。4.HE染色：從10％福爾馬林液中取出浸泡的股骨頭標(biāo)本，于股骨頸基底處鋸開，把標(biāo)本做好標(biāo)記，用8％甲酸溶液把標(biāo)本脫鈣，共換液三次，脫鈣時(shí)間為兩周。脫水、透明、浸蠟、修塊

7、，做成5μm切片，水浴，鋪片，烤片。最后做HE染色：熔蠟，酒精梯度水化，亞甲蘭染色，酸化，返蘭，伊紅染色，再用酒精梯度脫水，透明。再用光學(xué)樹脂封片。5.X線及組織學(xué)觀察：通過X射線片觀看股骨頭標(biāo)本鉆孔區(qū)骨密度和骨小梁的改變狀況。蘇木精-伊紅染色切片，光鏡觀看股骨頭標(biāo)本鉆孔區(qū)細(xì)胞及骨小梁的改變狀況。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，分析股骨頭標(biāo)本缺損區(qū)新生成的骨小梁圖像，對(duì)其面積百分比均值進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。
　　結(jié)果：1

8、.標(biāo)本股骨頭X線檢查：A組2周時(shí)標(biāo)本X線顯示，鉆孔區(qū)以外的骨小梁結(jié)構(gòu)完整，鉆孔區(qū)內(nèi)在植入液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)的部位高密度影較明顯。4周標(biāo)本X線顯示，鉆孔區(qū)以外的骨質(zhì)密度增加，但鉆孔區(qū)以外的骨小梁結(jié)構(gòu)完整，鉆孔區(qū)內(nèi)植入物密度有輕度減低。6周時(shí)標(biāo)本X線顯示，鉆孔缺損區(qū)以外骨質(zhì)密度增加，鉆孔區(qū)以外的骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，在鉆孔區(qū)內(nèi)所植液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)部分的密度略高，有骨小梁出現(xiàn)，鉆孔區(qū)內(nèi)所植物與鉆孔區(qū)

9、外界限模糊。第8周時(shí)標(biāo)本X線顯示，在股骨頭鉆孔缺損區(qū)以外的骨密度增加，骨小梁出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，并且有骨下囊樣變。在實(shí)驗(yàn)股骨頭鉆孔區(qū)內(nèi)植入物有部分骨密度接近正常，有骨小梁出現(xiàn)，鉆孔區(qū)內(nèi)植入物與鉆孔區(qū)外界限模糊程度比6周時(shí)的標(biāo)本加重。B組：2周時(shí)實(shí)驗(yàn)股骨頭標(biāo)本X線顯示鉆孔區(qū)以外骨質(zhì)密度增加，骨小梁結(jié)構(gòu)完整鉆孔區(qū)內(nèi)所植物的密度減低。4周時(shí)的標(biāo)本顯示實(shí)驗(yàn)股骨頭標(biāo)本鉆孔區(qū)外骨質(zhì)密度增加，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，在鉆孔區(qū)內(nèi)植入物密度增高，但與正常骨密度相比，還

10、顯略低。6周時(shí)的實(shí)驗(yàn)股骨頭標(biāo)本顯示在鉆孔區(qū)以外骨質(zhì)密度有所增加，骨小梁出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，同時(shí)有軟骨下囊樣變性。在鉆孔區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)有稀疏骨小梁。8周時(shí)的標(biāo)本顯示，實(shí)驗(yàn)股骨頭標(biāo)本在鉆孔區(qū)以外的骨質(zhì)密度增加，骨小梁出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，并且出現(xiàn)軟骨下囊樣變性。在鉆孔區(qū)內(nèi)可發(fā)現(xiàn)有骨小梁，植入物密度接近正常，植入物與鉆孔區(qū)界限表現(xiàn)模糊?？傮w而言A組實(shí)驗(yàn)股骨頭缺損區(qū)內(nèi)植入的液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)的密度由高逐漸降低最后接近正常骨小梁。B組實(shí)驗(yàn)股骨

11、頭的缺損區(qū)內(nèi)植入的BMSCs+明膠海綿顆粒+自體松質(zhì)骨顆粒，密度開始降低然后再升高，最后接近正常骨小梁結(jié)構(gòu)。2.實(shí)驗(yàn)股骨頭標(biāo)本的組織學(xué)檢查：A組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的股骨頭標(biāo)本術(shù)后2周時(shí)，在實(shí)驗(yàn)股骨頭標(biāo)本的鉆孔缺損區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)缺損區(qū)邊緣有較多的新生骨小梁及類骨質(zhì)，缺損區(qū)內(nèi)有大量的成骨細(xì)胞。4周時(shí)股骨頭的缺損區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)有類骨質(zhì)填充及大量骨小梁形成。6周時(shí)實(shí)驗(yàn)股骨頭缺損區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)骨髓組織及較成熟的骨小梁。在第8周時(shí)發(fā)現(xiàn)股骨頭缺損區(qū)內(nèi)有大量骨髓組織及成熟的骨小梁

12、。B組術(shù)后2周時(shí)，在鉆孔區(qū)中心被炎癥細(xì)胞充填，在鉆孔區(qū)的邊緣有較多的新生骨組織，在新生骨的內(nèi)側(cè)有一個(gè)成骨細(xì)胞層。4周時(shí)在實(shí)驗(yàn)股骨頭標(biāo)本的鉆空區(qū)內(nèi)有較多的新生骨小梁，但并未充滿整個(gè)股骨頭，有的有少量骨組織在標(biāo)本鉆孔區(qū)的中央，有的在鉆孔區(qū)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)骨組織。6周時(shí)比4周時(shí)的情況是有血管出現(xiàn)，有骨髓組織，骨小梁較成熟。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)股骨頭鉆孔區(qū)邊緣被骨髓組織、骨小梁組織充滿。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：術(shù)后8周時(shí)，A、B兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭缺損區(qū)內(nèi)的骨小梁