不同耐寒性甘蔗品種對低溫的響應(yīng)機(jī)制.pdf

1、甘蔗是主要的糖料作物,我國南方蔗區(qū)每年都因低溫危害造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失,研究低溫對甘蔗的傷害機(jī)理以及甘蔗抗寒的生理、細(xì)胞及分子機(jī)制,對于甘蔗抗寒栽培、育種等具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究從大田種植的35個(gè)甘蔗品種中后期生長經(jīng)自然低溫脅迫后篩選出4個(gè)最耐寒和4個(gè)最不耐寒的品種,進(jìn)行組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化研究,確定一些與抗寒性相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)和品種,并利用人工低溫脅迫,從組織細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方面研究不同耐寒甘蔗品種響

2、應(yīng)低溫的差異,旨在全面了解甘蔗耐低溫的機(jī)制,為甘蔗的抗寒育種和生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果如下:
　　 1.甘蔗品種的耐寒性差異及抗寒指標(biāo)的篩選
　　 在廣西霜、雪、冰期最早、最長的縣份之一的資源縣種植35個(gè)甘蔗品種,持續(xù)降溫后發(fā)現(xiàn)不同甘蔗品種對低溫的反應(yīng)各異,從中選出4個(gè)耐寒較強(qiáng)和4個(gè)耐寒性較弱的甘蔗品種詳細(xì)調(diào)查莖的水漬狀節(jié)間數(shù)、綠葉數(shù)、錘度、蔗糖分,莖尖褐變指數(shù),葉綠素含量等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)大部分品種間各個(gè)指標(biāo)均達(dá)差異顯著水平,

3、然后再用隸屬函數(shù)綜合分析法分析8個(gè)供試品種的耐寒性,按大小順序依次為:桂糖28號＞桂糖21號＞福農(nóng)15號＞贛蔗18號＞新臺糖22號＞臺糖98/0432＞園林8號＞園林6號,其中桂糖28號最耐寒,園林6號最不耐寒。
　　 利用離析法、切片法和掃描電鏡觀察法研究8個(gè)甘蔗品種成熟期葉片組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn),結(jié)合相關(guān)函數(shù)分析法探討正常條件下甘蔗組織結(jié)構(gòu)特征與耐寒性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn);甘蔗葉片厚度、角質(zhì)層厚度、泡狀細(xì)胞面積、硅細(xì)胞面積、硅細(xì)胞密度、

4、厚壁細(xì)胞面積、氣孔器長度均與甘蔗耐寒性呈顯著或極顯著正相關(guān),而長細(xì)胞密度、長細(xì)胞面積、氣孔器寬度、氣孔器密度、氣孔器面積、氣孔寬/長均與甘蔗耐寒性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān),說明以上指標(biāo)可以作為甘蔗耐寒品種篩選的參考依據(jù)。
　　 自然降溫后,所有供試品種均表現(xiàn)葉片細(xì)胞損傷度上升,葉片厚度下降,角質(zhì)層、葉綠體、氣孔器密度增加,開放氣孔器數(shù)、氣孔器面積、氣孔器寬度、氣孔器長度、氣孔器寬/長下降的趨勢,但耐寒甘蔗品種比不耐寒品種細(xì)胞損傷度程

5、度低,葉片厚度下降慢而少,角質(zhì)層、葉綠體、氣孔器密度增加多,開放氣孔器數(shù)、氣孔面積、氣孔寬度、氣孔長度、氣孔寬/長下降少,從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的忍受低溫脅迫的能力,說明甘蔗耐寒品種比不耐寒品種具有更強(qiáng)的適應(yīng)低溫的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。利用以上指標(biāo)作隸屬函數(shù)綜合評價(jià)8個(gè)供試品種的耐寒性,得出的結(jié)果與用常規(guī)形態(tài)生理指標(biāo)評價(jià)的結(jié)果基本一致,說明細(xì)胞綜合性指標(biāo)可以作為甘蔗耐寒品種的評價(jià)依據(jù)。
　　 2.甘蔗超微結(jié)構(gòu)和微管骨架對低溫的響應(yīng)
　　

6、低溫脅迫前,耐寒品種桂糖28號(GT28)和不耐寒品種園林6號(YL6)葉片和莖尖外形差異不明顯:但低溫脅迫后,園林6號無論是莖尖還是葉片均比桂糖28號受寒害癥狀嚴(yán)重。
　　 利用超薄切片結(jié)合電子顯微鏡觀察技術(shù)研究低溫脅迫(0d、2d、4d和6d)后桂糖28號和園林6號的超微結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)果表明:隨著低溫脅迫時(shí)間的延長,園林6號葉片中葉綠體膜破損,葉綠體上脂質(zhì)粒和淀粉粒增多,葉綠體拉長、質(zhì)壁分離、原生質(zhì)體收縮,細(xì)胞死亡嚴(yán)重;莖尖

7、細(xì)胞質(zhì)和線粒體空泡化、質(zhì)壁分離、原生質(zhì)體收縮,細(xì)胞死亡也很嚴(yán)重。而桂糖28號無論是葉片還是莖尖超微結(jié)構(gòu)受低溫影響明顯低于園林6號,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)桂糖28號液泡發(fā)生明顯內(nèi)陷,線粒體數(shù)目增多,說明桂糖28號比園林6號具有更耐寒的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。根據(jù)本研究的結(jié)果,莖尖超微結(jié)構(gòu)比葉片對低溫的反應(yīng)更為敏感。
　　 利用免疫組織學(xué)技術(shù)研究低溫脅迫前后甘蔗葉片微管蛋白分布和莖尖周質(zhì)微管列陣的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)低溫脅迫前,2個(gè)甘蔗品種葉片微管蛋白主

8、要分布在維管束鞘細(xì)胞、葉肉細(xì)胞和維管束內(nèi)的厚壁細(xì)胞中,熒光強(qiáng)且清晰,品種間分布部位和強(qiáng)度差異不明顯;隨著低溫脅迫時(shí)間的延長,園林6號各組織細(xì)胞微管蛋白明顯下降,而桂糖28號與低溫脅迫前比變化不明顯。(2)低溫脅迫前,兩個(gè)甘蔗品種莖尖細(xì)胞微管列陣以橫向排列為主且整齊有序,但桂糖28號微管列陣較園林6號密集;低溫脅迫后園林6號微管嚴(yán)重解聚、凝縮,細(xì)胞界限模糊;而桂糖28號周質(zhì)微管解聚的同時(shí)還有重新排序現(xiàn)象,形成橫向、縱向、斜向排列的更加致密

9、的網(wǎng)狀微管列陣,表明耐寒甘蔗品種桂糖28號微管骨架已形成對低溫適應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 3.甘蔗對低溫響應(yīng)的生理生化基礎(chǔ)
　　 對甘蔗葉片與莖尖一些相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行研究結(jié)果表明:低溫脅迫后,兩個(gè)甘蔗品種葉片的葉綠素含量、光合速率、Ca2+-ATP酶活性均有不同程度下降,最終使電導(dǎo)率,丙二醛、脯氨酸含量提高,這些變化可能是甘蔗對低溫適應(yīng)的一種生理學(xué)機(jī)制;在低溫脅迫過程中,耐寒甘蔗品種桂糖28號比園林6號具較高的光合速率,葉綠

10、素、脯氨酸含量及Ca2+-ATP酶活性,這可能是桂糖28號具有更強(qiáng)的抵御低溫脅迫的生理生化基礎(chǔ)。葉片和莖尖的生理生化變化趨勢基本一致,但莖尖比葉片反應(yīng)更為敏感。
　　 4.不同耐寒性甘蔗品種蛋白質(zhì)組學(xué)水平對低溫響應(yīng)的差異
　　 利用雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)并結(jié)合免疫印跡和免疫組化等方法研究不同耐寒甘蔗品種莖尖蛋白質(zhì)水平對低溫的響應(yīng)機(jī)制,發(fā)現(xiàn)桂糖28號和園林6號在低溫脅迫(0d和4d)后進(jìn)行雙向電泳,在每張圖片上大約檢測到100

11、0多個(gè)可溶性蛋白點(diǎn),用PDQuest軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的找點(diǎn)、定量和匹配及統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)低溫脅迫4d后有12個(gè)蛋白在2個(gè)甘蔗品種中都呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá);13個(gè)蛋白質(zhì)在2個(gè)甘蔗品種中都呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá);有9個(gè)蛋白在桂糖28號呈上調(diào)表達(dá),而在園林6號呈下調(diào)表達(dá);3個(gè)蛋白在桂糖28號呈下調(diào)表達(dá),而在園林6號里上調(diào)表達(dá);1個(gè)蛋白在桂糖28號不表達(dá),但在園林6號呈上調(diào)表達(dá);1個(gè)蛋白在桂糖28號下調(diào)表達(dá),但在園林6號不表達(dá);1個(gè)蛋白在桂糖28號上調(diào)表達(dá),但在園林

12、6號不表達(dá)。以上40個(gè)蛋白豐度差異表達(dá)變化均在2倍以上。對這40個(gè)蛋白差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,有20個(gè)蛋白點(diǎn)得到了有效鑒定,這些蛋白在防御反應(yīng)、代謝、細(xì)胞骨架、能量、信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。應(yīng)用免疫印跡和免疫組化對α-tublin差異蛋白進(jìn)行蛋白表達(dá)情況驗(yàn)證,結(jié)果與蛋白組學(xué)的研究結(jié)果相符,說明這些差異蛋白可能參與植物體內(nèi)多個(gè)生理過程,它們共同作用,使耐寒型甘蔗在低溫條件下建立了新的平衡,這可能是桂糖28號耐低溫的蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)。

13、　　 5.甘蔗對低溫響應(yīng)的鈣信號系統(tǒng)差異
　　 利用植物組織化學(xué)結(jié)合電子顯微鏡觀察技術(shù)研究桂糖28號和園林6號莖尖低溫脅迫前后cE+和Ca2+-ATP酶的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)低溫脅迫開始,2個(gè)甘蔗品種細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核Ca2+沉淀顆粒均增多,但隨著低溫脅迫時(shí)間的延長桂糖28號細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核Ca2+沉淀顆粒減少,并維持在一個(gè)低穩(wěn)態(tài)水平,而園林6號細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核一直維持在高Ca2+濃度水平;(2)低溫對桂糖28號Ca2+-A

14、TP酶活性與分布影響不大,其活性一直維持在較高水平,而園林6號質(zhì)膜上的Ca2+-ATP酶隨著低溫脅迫時(shí)間的延長而變少。結(jié)果說明,低溫條件下細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度增高是導(dǎo)致甘蔗莖尖細(xì)胞受傷害的重要原因,桂糖28號具有較高的Ca2+-ATP酶活性有助于避免Ca2+中毒,減少細(xì)胞受傷害。
　　 綜上所述,甘蔗的抗寒能力存在著品種間的差異,耐寒品種在冷信號傳導(dǎo)機(jī)制和防御應(yīng)激蛋白的表達(dá)上明顯不同于不耐寒品種,由于蛋白的表達(dá)差異造成了微管蛋白時(shí)