構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球的實驗研究.pdf

1、隨著醫(yī)學科學發(fā)展，人們對生活質(zhì)量期望值的提高，關(guān)節(jié)感染是許多關(guān)節(jié)外科醫(yī)生亟需解決的問題，特別是嚴重的關(guān)節(jié)感染，同時合并有大量的關(guān)節(jié)軟骨損傷或是大面積軟骨剝脫傷。關(guān)節(jié)感染以及軟骨損傷修復的難度在于：關(guān)節(jié)腔是存在極低循環(huán)的密閉腔室，全身應(yīng)用抗生素的血藥濃度對于關(guān)節(jié)腔內(nèi)細菌的作用是微乎其微，局部注射抗生素也存在導致外源性感染的可能性以及細菌耐藥，反復的注射疼痛也讓病人望而生畏；由于關(guān)節(jié)軟骨具有無神經(jīng)支配、缺乏血液供應(yīng)、軟骨細胞增殖遷移能力低等

2、組織學特點，關(guān)節(jié)軟骨自身修復能力非常有限。關(guān)節(jié)面軟骨組織損傷后之所以難以自行修復，是因為軟骨細胞在體內(nèi)缺乏增殖能力。因此本課題通過構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鹽三維共培養(yǎng)體系，通過大體觀察，H-E 染色、甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原染色、微生物法等檢測方法，了解三維凝珠慶大霉素的緩釋情況，觀察BMSCs的細胞形態(tài)、增殖能力及表型的變化，以及慶大霉素對BMSCs細胞和軟骨細胞增殖及分化的影響。
　　 目的：構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻

3、酸鹽三維共培養(yǎng)體系，檢測三維緩釋凝珠慶大霉素的釋放情況，觀察BMSCs的細胞形態(tài)、增殖能力及表型的變化，以及慶大霉素對BMSCs細胞和軟骨細胞增殖及分化的影響。
　　 方法：1、采用貼壁篩選法從兔骨髓組織中分離、純化BMSCs，進行體外平面培養(yǎng)擴增，應(yīng)用H-E 染色、免疫組化CD34、CD44、CD105抗體染色等方法對細胞表型、純度進行鑒定。2、采用藻酸鹽凝膠與BMSCs構(gòu)建三維共培養(yǎng)體系，通過細胞計數(shù)、繪制生長曲線、H-E

4、染色、甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色等觀察藻酸鹽三維凝膠中細胞生物學性狀的變化。3、構(gòu)建慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋凝珠U、S、T 共3組，通過紫外分光光度法及微生物法檢測釋放的藥物濃度及持續(xù)時間，計算藥物累積釋放量與各時間段的點釋放量，并與含慶大霉素的骨水泥Y組作比較，尋找合適的濃度配比，使慶大霉素的釋放更加穩(wěn)定持久。4、構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鹽三維緩釋共培養(yǎng)體系，通過細胞計數(shù)、繪制生長曲線、H-E 染色、甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠

5、原免疫組化染色等觀察BMSCs的細胞形態(tài)、增殖能力及表型的變化，以及慶大霉素對BMSCs細胞和軟骨細胞增殖及分化的影響。
　　 結(jié)果：1、培養(yǎng)的BMSCs 貼壁能力很強，細胞形態(tài)為短梭形或紡錘形，細胞形態(tài)、大小相近；采用免疫細胞化學檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的第1-3代細胞表達細胞表面抗原CD44、CD105，不表達CD34；同時，Ⅱ型膠原免疫組化染色陰性，顯示所培養(yǎng)的細胞為未分化的BMSCs。2、藻酸鹽凝膠具有一定的彈性和強度及良好的組織相

6、容性，BMSCs在藻酸鹽凝珠中具有良好的生物學活性；經(jīng)過2周以上的藻酸鹽三維凝珠培養(yǎng)，免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)支架細胞的Ⅱ型膠原染色陽性、甲苯胺藍染色也呈陽性改變，說明藻酸鹽三維培養(yǎng)微環(huán)境可誘導BMSCs 定向分化成軟骨細胞。3、U組慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋凝珠的慶大霉素累積釋放量與慶大霉素骨水泥Y組沒有顯著性差異，與S、T組有顯著性差異，釋放情況優(yōu)于S、T組，S、T組間無顯著性差異。U組各時間段的點釋放量與Y組有顯著性差異，與S、T組有顯著性

7、差異，S、T組間無顯著性差異。從各時間段的點釋放量與時間的曲線圖可以看出U、Y組整體釋放較為接近，而U組早期(前24h)的藥物釋放要大于Y組和S、T組。各組在30天的檢測時間里都能檢測出藥物的釋放，且大于最小抑菌濃度。4、BMSCs在構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鹽三維緩釋共培養(yǎng)體系中具有良好的生物學活性；經(jīng)過大體觀察，倒置顯微鏡觀察BMSCs的生長情況良好，細胞生長曲線基本正常，經(jīng)過2周以上的藻酸鹽三維凝珠培養(yǎng)，免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)細胞的

8、Ⅱ型膠原染色陽性，甲苯胺藍染色也呈陽性改變，呈軟骨細胞表型。
　　 結(jié)論：1. 實驗采用貼壁篩選法分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)免疫組化檢測CD34、CD44、CD105抗體免疫組化染色陽性，Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色陰性，符合BMSCs的特點，證明通過該方法可以成功獲取到高純度、未分化的骨髓間充質(zhì)干細胞。2.構(gòu)建BMSCs-藻酸鹽天然支架材料三維立體培養(yǎng)體系，經(jīng)過大體觀察，倒置顯微鏡觀察BMSCs的生長情況，細胞生長曲線的繪制

9、，證實BMSCs在該支架材料三維立體生長增殖良好，培養(yǎng)第7-21天細胞增殖明顯，較平面培養(yǎng)獲得更多的細胞量，為BMSCs 提供良好的生長微環(huán)境，并且BMSCs 可以保持良好的生物學形態(tài)，于培養(yǎng)2周時能夠分化為軟骨細胞，經(jīng)免疫組化檢測Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色陽性，甲苯胺藍染色呈陽性改變。3、慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋凝珠能夠長期持久的釋放慶大霉素，并在局部達到最小抑菌濃度。在30天的檢測時間里，按U組配制方案獲得的藻酸鈣凝珠包封率達53.9