類骨結構膠原纖維基多孔磷酸三鈣-膠原復合材料的制備及其生物學評價.pdf

1、骨缺損、骨不連的修復，一直是骨科領域的棘手問題，人們采用許多修復辦法如自體骨移植、同種異體骨移植、異種骨移植、金屬材料、陶瓷及人工合成的高分子材料等來修復骨缺損，但是它們都有各自的缺陷。如供體來源有限、免疫排異反應、難以降解、有毒及其它副反應。近年來設計仿生骨基質材料，為解決骨缺損及骨不連修復提供了全新的修復辦法，并己滲入到骨科各個領域，成為國內外研究的熱點之一。 仿生骨基質材料就是設計一種具有和天然骨基質類似的結構(結構仿生)

2、和功能(功能仿生)的骨基質材料。這種仿生骨基質材料應在體內除了應有良好的生物活性和降解性，具有促進或加速骨組織修復的效能是當前生物材料研究的重點。 本文基于自然骨的組元和微觀結構，通過微觀結構仿生與化學組元優(yōu)化相結合，將納米磷酸三鈣(TCP)顆粒與骨膠原微纖維復合成為類骨結構膠原纖維，從而可有效地利用TCP良好的生物降解特性、形貌變化特性、載體功能和膠原良好的細胞/組織相容性以及兩者的協(xié)同效應，期望構造出一種具有獨特微/納結構的

3、新型骨修復/再生材料，并通過體內、外系列實驗研究觀察其理化性能、生物相容性及其誘導、傳導成骨的能力，為骨組織高效重建創(chuàng)建良好的的初始平臺。 為此，本論文首先開展對復合材料的制備及其理化性能的系統(tǒng)研究和表征，然后進行了對類骨結構膠原纖維基復合材料的體外細胞相容性和生物活性研究，最后開展了類骨結構膠原纖維基復合材料對兔股骨骨缺損修復的體內實驗研究，初步評價了它的骨修復能力。 主要的研究內容如下： (1)經(jīng)過酸性介質對

4、膠原處理形成膠原微纖維，分別加入納米TCP顆粒，在濕化學條件下制成類骨結構膠原纖維基多孔B-TCP/Col復合材料，應用掃描電鏡觀察復合材料的顯微形貌、孔徑，測量孔隙率，并浸泡于PBS緩沖液中觀察B-TCP/Col復合材料的形貌變化。結果顯示：酸性條件下，類骨結構膠原纖維構成的孔壁成網(wǎng)狀；最佳酸性條件為pH=2；復合材料的孔徑在100μm左右，孔隙率為90％以上。經(jīng)過體外緩沖溶液的浸泡，復合材料表面行成花瓣簇狀形狀的HA，形成有利于成骨

5、細胞生長的表面結構。 (2)采用體外細胞培養(yǎng)技術，把成骨樣細胞MG63和類骨結構膠原纖維基多孔B-TCP/Col復合材料復合培養(yǎng)，以TCP和MG63分別做陽性和陰性對照，用MTT法檢測細胞的粘附和增殖變化：ALP活性測定觀察材料對細胞分化的影響；掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在材料中的生長和形態(tài)改變；逆轉錄．聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和半定量分析檢測材料對細胞內骨特異基因表達的影響以及利用流式細胞儀(FCM)觀察分析復合

6、材料對細胞周期的影響。 結果發(fā)現(xiàn)： ①細胞在種植到材料表面后隨時間延長而黏附的細胞數(shù)量增加，納米β-TCP/Col組高于單純TCP組(p<0.05)，而和空白對照組差別不顯著(p>0.05)。 ②細胞接種5天時，納米相TCP/Col表面的細胞增殖數(shù)明顯高于單純TcP組(p<0.05)，而和空白對照組無明顯差異(p>0.05)。 ③從復合培養(yǎng)的第5天起，納米相TCP/Col組細胞分泌的ALP開始增加明顯，且

7、高于單純TCP組，與空白對照組的增加無明顯差異。 ④形態(tài)學上SEM可以看到復合材料表面細胞呈扁平梭形，分布均勻、延展性好，隨著時間延長并可見到細胞基質分泌沉積；激光共聚焦顯微鏡顯示細胞核分裂活躍。 ⑤RT-PCR及半定量分析證實，TCP/Col與成骨細胞復合培養(yǎng)后，成骨樣細胞內骨鈣素和I型膠原的表達量明顯高于對照組(p<0.05)。 ⑥細胞周期分析顯示，TCP/Col提高了MG63細胞的細胞周期的S期細胞數(shù)百分比

8、，由正常的35.618％增加到了59.480％，表明增加了DNA的合成。 (3)選用健康新西蘭大白兔24只48側股骨髁做成圓柱狀骨缺損模型，將TCP/Col復合材料植入骨缺損處，設不植入任何材料的骨缺損做空白對照。術后2、4、8、12周進行X線攝片檢查，并取材做組織形態(tài)學、掃描電鏡觀察；并對股骨缺損局部骨密度進行測定，初步評價復合材料的骨修復能力。 結果發(fā)現(xiàn)： ①X線顯示，2周時骨缺損區(qū)密度逐漸增高，材料未發(fā)生大

9、量降解；4周時植入?yún)^(qū)域材料的輪廓變得模糊，植入?yún)^(qū)域的亮度開始下降，材料的密度開始逐漸降低；8周時缺損區(qū)邊緣模糊，密度繼續(xù)降低，植入體與宿主骨部分橋接，骨透射性進一步降低，骨組織向材料內部延伸，材料大部分被降解替代；12周時，材料形狀消失，密度與正常組織大致相當，材料與骨組織融合在一起，骨缺損基本被修復。而12周時，對照組缺損區(qū)有少量的骨癡和硬化，骨修復征象不明顯。 ②組織切片可見，材料植入2周時，缺損內見大量成骨細胞、纖維組織和

10、新生微血管長入；4周時，植入?yún)^(qū)有大量小梁骨組織及類骨質形成；8周時，支架材料大部分吸收，類骨質不斷增多，形成大量骨島；12周時，新骨大面積生成，新骨組織漸連接成片，可見哈佛氏系統(tǒng)：對照組在12周時，圓形缺損形態(tài)完整，未見到有明顯的骨組織形成。 ③骨密度檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組在4周以后骨礦化的速度較對照組明顯增高，在12周時，接近正常小梁骨的密度(p<0.05)。經(jīng)過上述研究，仿生TCP/Col復合材料具有和骨組織相類似的三維多孔結構，