炎癥因子和肌腱干細(xì)胞在肌腱病中的作用及干預(yù)研究.pdf

1、肌腱病是一種常見的軟組織疾病，多發(fā)于運(yùn)動(dòng)員及老齡化人群。肌腱鈣化及退化導(dǎo)致的疼痛，運(yùn)動(dòng)障礙及繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎等造成了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。但由于對肌腱病的發(fā)病機(jī)制了解有限，目前仍然缺少有效的肌腱病治療手段。因此，對肌腱鈣化及再生的細(xì)胞及分子機(jī)制的深入研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　炎癥對于組織損傷后的修復(fù)與再生至關(guān)重要。但是，慢性炎癥導(dǎo)致組織器官內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的破壞，參與了腫瘤、纖維化疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及脊柱關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)展

2、過程。肌腱病中多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子發(fā)生了改變。但是傳統(tǒng)的抗炎類藥物，如非甾體類抗炎藥(NSAIDs)和糖皮質(zhì)激素，僅僅具有鎮(zhèn)痛效果，而對于肌腱的功能恢復(fù)卻沒有顯著的促進(jìn)作用。肌腱內(nèi)源性干/祖細(xì)胞具有自我更新及多向分化潛能，參與了肌腱組織穩(wěn)態(tài)、修復(fù)及疾病的發(fā)生。肌腱損傷后，肌腱干/祖細(xì)胞表型改變、向軟骨分化能力增強(qiáng)而向肌腱系分化減弱是導(dǎo)致肌腱修復(fù)不良及異位骨化的主要因素之一，是促進(jìn)肌腱修復(fù)的潛在細(xì)胞靶點(diǎn)。但是，成體肌腱干/祖細(xì)胞在損傷后

3、的炎癥微環(huán)境中的再生功能如何改變及其調(diào)控的分子機(jī)制仍然有待明確。
　　近年來研究顯示，急性的、可控的炎癥反應(yīng)不僅清除致病因素，同時(shí)調(diào)控組織內(nèi)部干/祖細(xì)胞的增殖和分化以及血管形成，促進(jìn)受損組織的再生。由于炎癥反應(yīng)所包涵的細(xì)胞和炎癥因子種類繁多且功能各異，為了實(shí)現(xiàn)有效的組織再生，需要高度特異性地抑制炎癥反應(yīng)的負(fù)面作用，同時(shí)允許炎癥反應(yīng)發(fā)揮應(yīng)有的正向的調(diào)控作用。因此，對不同時(shí)期免疫反應(yīng)的性質(zhì)和強(qiáng)度進(jìn)行區(qū)分并進(jìn)行其對肌腱干/祖細(xì)胞調(diào)控功能

4、的研究，有助于進(jìn)一步明確肌腱修復(fù)及鈣化過程中的免疫調(diào)控機(jī)制，開發(fā)新的有效的肌腱病治療手段。
　　本研究的目的在于:(1)研究肌腱損傷及病理發(fā)展的不同時(shí)期，各種炎癥因子表達(dá)水平的變化，通過其變化趨勢分析不同時(shí)期參與肌腱修復(fù)調(diào)控的主要炎癥因子;(2)研究炎癥因子對于肌腱干細(xì)胞(Tendon Stem/Progenitor Cells，TSPCs)功能的調(diào)控作用，明確促進(jìn)肌腱再生和抑制肌腱修復(fù)的主要炎癥因子;(3)在分子水平探索該炎癥因

5、子調(diào)控TSPCs分化的作用機(jī)制;(4)設(shè)計(jì)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步運(yùn)用小分子調(diào)控內(nèi)源TSPCs功能抑制肌腱鈣化、促進(jìn)肌腱修復(fù)。
　　我們的研究結(jié)果分為以下四個(gè)部分:
　　一、炎癥因子在肌腱病不同時(shí)期的表達(dá)譜分析
　　為明確炎癥因子在肌腱病不同時(shí)期的表達(dá)變化，我們通過肌腱內(nèi)部注射Ⅰ型膠原酶建立大鼠肌腱病模型，在肌腱病發(fā)展的不同階段分別提取肌腱組織內(nèi)部的蛋白，進(jìn)行炎癥因子表達(dá)譜分析。通過分析，我們發(fā)現(xiàn)肌腱損傷后1周內(nèi)，組織內(nèi)有大

6、量炎癥細(xì)胞浸潤，同時(shí)促炎癥因子白介素-1beta(IL-1β)水平顯著升高;損傷后2周，抗炎癥因子白介素-4（IL-4）和白介素-10(IL-10)水平上調(diào)，同時(shí)伴隨炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，提示其免疫反應(yīng)類型具有時(shí)期特異性。進(jìn)一步分析損傷8周的慢性肌腱病組織，我們發(fā)現(xiàn)肌腱內(nèi)部炎癥細(xì)胞浸潤進(jìn)一步減少，但是鈣化點(diǎn)周圍促炎癥信號通路NF-κB上調(diào)。另外，臨床人體芯片結(jié)果顯示慢性肌腱病組織與正常肌腱組織相比，促炎癥因子白介素-1 al pha(IL-

7、1α)及IL-1β有較低程度的上調(diào)，而抑炎癥因子IL-4和IL-10表達(dá)下調(diào)，提示慢性肌腱病中炎癥因子平衡失調(diào)。
　　以上結(jié)果顯示，肌腱損傷后促炎癥因子與抑炎癥因子依次上調(diào)，參與了炎癥的激活和消退;而慢性肌腱病中促炎癥因子和抑炎癥因子的平衡失調(diào)，可能參與了疾病的發(fā)展。
　　二、炎癥因子對于肌腱修復(fù)及鈣化的調(diào)控作用研究
　　為了探討體內(nèi)急性炎癥因子水平改變對于肌腱組織及鈣化的調(diào)控作用，我們分別用IL-1β(5ng/ml)

8、，IL-4(10ng/ml，20ng/ml)、M1和M2巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基短期（3天）處理體外培養(yǎng)的肌腱組織。結(jié)果顯示IL-4（20ng/ml）、M1和M2巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以維持和誘導(dǎo)肌腱特異的轉(zhuǎn)錄因子Scleraxis(Scx)的表達(dá)，而IL-1β(5ng/ml)會(huì)抑制Scx的表達(dá)。用IL-1β(5ng/ml)處理1周后，Scx表達(dá)持續(xù)降低，而TSPCs的增殖能力及軟骨系轉(zhuǎn)錄因子Sox9表達(dá)上調(diào);在含IL-1β誘導(dǎo)肌腱分化培養(yǎng)

9、基中，TSPCs的腱系分化降低;在骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，堿性磷酸酶(ALP)染色增強(qiáng)。為了進(jìn)一步明確IL-1β對于肌腱干細(xì)胞(TSPCs)的調(diào)控作用，我們對三維培養(yǎng)的TSPCs分別進(jìn)行IL-1β(5ng/ml)5天和8天的處理后去除IL-1β并繼續(xù)培養(yǎng)5天，結(jié)果顯示短期IL-1β處理對于TSPCs中Scx表達(dá)的抑制作用為可逆性的，而IL-1β長期處理后Scx表達(dá)不可恢復(fù)。
　　綜上所述，促炎癥因子IL-1β促進(jìn)TSPCs增殖且可逆性降

10、低Scx表達(dá)，后期M2分泌的細(xì)胞因子，如抗炎癥因子IL-4可誘導(dǎo)TSPCs的Scx表達(dá)，有助于肌腱修復(fù)再生;而慢性炎癥中，促炎癥因子IL-1β導(dǎo)致TSPCs的Scx表達(dá)長期下調(diào)，抑制修復(fù)性的TSPCs向肌腱系分化，促進(jìn)病理性的TSPCs向骨系分化，參與了鈣化性肌腱病的發(fā)展。
　　三、HIF-2α介導(dǎo)促炎癥因子IL-1β調(diào)控TSPCs分化的機(jī)制研究
　　為了進(jìn)一步明確IL-1β調(diào)控TSPCs分化的分子機(jī)制，我們對于肌腱病表達(dá)芯

11、片進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子-2alpha（HIF-2α）顯著上調(diào)。通過免疫染色，免疫印跡，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示HIF-2α在正常肌腱中低表達(dá)，而在肌腱病樣本中顯著上調(diào)，且HIF-2α可被IL-1β(5ng/ml)誘導(dǎo)。過表達(dá)HIF-2α可抑制腱系基因的表達(dá)并促進(jìn)TSPCs向骨系分化，利用特異靶向HIF-2α的shRNA降低內(nèi)源HIF-2α表達(dá)后，可顯著抑制IL-1β(5ng/ml)處理下TSPCs的骨系分化。肌腱特異轉(zhuǎn)錄因子Sc

12、x轉(zhuǎn)錄啟示序列區(qū)有幾個(gè)在脊椎動(dòng)物中保守的HIF-2α應(yīng)答元件（HRE），過表達(dá)HIF-2α可抑制TSPCs中Scx表達(dá)，敲低HIF-2α可逆轉(zhuǎn)IL-1β處理下Scx表達(dá)的降低，而過表達(dá)Scx可部分抑制過表達(dá)HIF-2α導(dǎo)致的TSPCs骨化增強(qiáng)。
　　綜上所述，IL-1β通過激活HIF-2α，從而負(fù)向調(diào)控由Scx維持的肌腱系特異基因表達(dá)，上調(diào)骨軟骨系基因表達(dá)，從而促進(jìn)TSPCs向骨系分化增強(qiáng)。
　　四、運(yùn)用小分子調(diào)控TSPCs

13、功能促進(jìn)肌腱再生研究
　　為了靶向調(diào)控因IL-1β慢性升高產(chǎn)生的炎癥因子平衡破壞導(dǎo)致的TSPCs分化功能異常，從而促進(jìn)肌腱再生，我們運(yùn)用小分子阻斷NF-κB和HN-2α信號通路，促進(jìn)內(nèi)源性TSPCs的腱系分化及肌腱再生。體外結(jié)果顯示，地高辛(digoxin)可抑制炎癥病理環(huán)境下HIF-2α信號通路，促進(jìn)TSPCs向腱系分化，抑制其骨系分化。肌腱損傷3天后給予地高辛治療能顯著抑制肌腱異位鈣化，促進(jìn)肌腱修復(fù)。基因表達(dá)檢測顯示地高辛能夠

14、提升Scx表達(dá)水平，降低軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)膠原Ⅱ表達(dá)。提示地高辛體內(nèi)也可調(diào)控內(nèi)源性TSPCs向腱系分化。以往研究顯示姜黃素(curcumin)可抑制NF-κB信號通路。我們的體外實(shí)驗(yàn)顯示，IL-1β刺激下給予姜黃素處理，可促進(jìn)TSPCs的增殖及維持Scx表達(dá)。肌腱損傷3天后，體內(nèi)給予姜黃素治療6周，可提升抗炎癥因子IL-4和IL-10水平，下調(diào)促炎癥因子IL-1α水平，體外實(shí)驗(yàn)顯示，姜黃素處理后的巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基有助于誘導(dǎo)培養(yǎng)的肌腱

15、組織的Scx表達(dá)。組織學(xué)分析顯示姜黃素處理提升肌腱細(xì)胞外基質(zhì)合成及膠原直徑。提示姜黃素可通過直接作用于TSPCs以及間接調(diào)控炎癥微環(huán)境的平衡促進(jìn)肌腱修復(fù)。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在肌腱損傷后的急性炎癥反應(yīng)時(shí)期，促炎癥因子IL-1β和抑炎癥因子IL-4和IL-10序貫性地上調(diào)，可促進(jìn)肌腱干細(xì)胞(TSPCs)階段性地增殖及腱系分化;而慢性病理肌腱組織中促炎癥因子IL-1β長期上調(diào)而抑炎癥因子IL-4和IL-10長期下調(diào)，導(dǎo)致炎癥微環(huán)境

16、的失衡。TSPCs的肌腱特異轉(zhuǎn)錄因子Scx表達(dá)下調(diào)、腱系分化能力下降但骨系分化能力增強(qiáng)，參與了肌腱異位鈣化的形成。在機(jī)制分析中，我們通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，IL-1β刺激可上調(diào)HIF-2α信號通路，抑制肌腱特異轉(zhuǎn)錄因子Scx及肌腱特異基因表達(dá)，從而導(dǎo)致TSPCs異常分化形成肌腱異位骨化。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)用小分子藥物地高辛可調(diào)控內(nèi)源TSPCs對于慢性炎癥微環(huán)境的響應(yīng)，抑制其骨系分化并促進(jìn)其向腱系分化;而姜黃素可同時(shí)調(diào)控失衡的炎癥微環(huán)境及TSP