恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖、分化規(guī)律及其電生理特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一.概述神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的特殊細(xì)胞。通過(guò)研究NSCs，不僅可以探討神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機(jī)制，而且可利用其作為一種替代手段用于中樞神經(jīng)損傷、退行性疾病和腦腫瘤等疾病的治療。建立穩(wěn)定、可靠的NSCs體外培養(yǎng)體系，探索其增殖規(guī)律及分化機(jī)理是神經(jīng)干細(xì)胞研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。由于胚胎來(lái)源的NSCs受到組織來(lái)源、免疫排斥、倫理道德等方面的束縛而使其應(yīng)用前景受到限制，所以，骨髓基質(zhì)

2、細(xì)胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)的分離、培養(yǎng)成功，多分化潛能的發(fā)現(xiàn)和向NSCs方向分化的初步研究，為NSCs的來(lái)源提供了新的途徑，使得“自體源性NSCs”的廣泛應(yīng)用成為可能。骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)干細(xì)胞(BMSCs-derivedNSCs，BMSCs-D-NSCs)的誘導(dǎo)成功，將解決胎腦源性NSCs數(shù)量不足的問(wèn)題，避免倫理學(xué)方面的爭(zhēng)議，同時(shí)也可避免異體組織細(xì)胞移植可能存在的免疫排斥反應(yīng)，是移植治療神經(jīng)功能障

3、礙性疾病的理想細(xì)胞來(lái)源。故骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞有著廣闊的應(yīng)用前景，成為目前神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的關(guān)注焦點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)以靈長(zhǎng)類動(dòng)物恒河猴骨髓為研究對(duì)象，對(duì)BMSCs進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)條件下的體外分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，觀察各種生長(zhǎng)因子對(duì)BMSCs-D-NSCs的體外增殖作用，比較不同生長(zhǎng)因子體外誘導(dǎo)分化的效能，并應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞抗原性質(zhì)鑒定，膜片鉗技術(shù)檢測(cè)分化細(xì)胞的電生理特性，為成體源性NSCs在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4、 神經(jīng)干細(xì)胞研究的目的就是應(yīng)用其結(jié)構(gòu)和功能的可塑性來(lái)修復(fù)發(fā)生損傷或退行性病變的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此，分化自BMSCs-D-NSCs的神經(jīng)元樣細(xì)胞功能成熟更為重要。我們課題組的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)從骨髓中分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞，且能夠誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。盡管這些神經(jīng)元樣細(xì)胞具備了神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征，但是還不能確定其是否真正具有了神經(jīng)元的生理功能。膜片鉗技術(shù)(patch-clamptechnique)是1976年由Nehetr和Sakman

5、n在電壓鉗的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種記錄細(xì)胞膜離子通道電生理活動(dòng)的技術(shù)。其突出優(yōu)點(diǎn)是能夠在維持細(xì)胞興奮過(guò)程中膜電位恒定的同時(shí)，直接記錄離子通道電流，反映單一的(或多個(gè)的)離子通道分子活動(dòng)。此技術(shù)的出現(xiàn)將細(xì)胞水平和分子水平的生理學(xué)研究聯(lián)系在一起，同時(shí)又將神經(jīng)科學(xué)的不同領(lǐng)域融匯成一體，是對(duì)生理科學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的重大變革。本研究在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用膜片鉗技術(shù)對(duì)BMSCs-D-NSCs及其分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞進(jìn)行了電生理特性檢測(cè)和比較分析，結(jié)果證實(shí)，BMSC

6、s-D-NSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞具有活躍的電生理特性，它不僅具有興奮性細(xì)胞所具有的典型的電壓依賴性的快速激活的Na+內(nèi)向電流，而且還記錄到了包括兩種成分的外向K+電流：瞬時(shí)K+外向電流和延遲整流K+外向電流，類似于神經(jīng)細(xì)胞的K+電流。 二.本實(shí)驗(yàn)的主要方法和結(jié)果：1.BMSCs-D-NSCs的分離純化及性質(zhì)鑒定： 由恒河猴骨髓內(nèi)取骨髓血，密度梯度離心法分離、純化恒河猴BMSCs。在體外應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(本實(shí)驗(yàn)室

7、配制，專利號(hào)：ZL.02134314.4)進(jìn)行BMSCs向NSCs的誘導(dǎo)分化。培養(yǎng)的不同階段用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)細(xì)胞抗原性質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，恒河猴BMSCs能在體外培養(yǎng)中增殖、分化為NSCs，增殖的中等偏大的圓形或卵圓形細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)和CD133抗原，并能進(jìn)一步分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)可見(jiàn)神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)微管蛋白(β-tubulin)，以及膠質(zhì)

8、細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)陽(yáng)性表達(dá)。說(shuō)明BMSCs誘導(dǎo)成為NSCs，并能向神經(jīng)系細(xì)胞方向分化。 2.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)BMSCs來(lái)源的NSCs的體外促增殖作用： 本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔剿鰾MSCs體外誘導(dǎo)分化為NSCs的增殖條件，比較bFGF、EGF對(duì)NSCs生長(zhǎng)曲線的影響。對(duì)所提取的骨髓基質(zhì)細(xì)胞懸液按0.5×106個(gè)/mL接種于24孔培養(yǎng)板中，加15％濃度的胎牛

9、血清，在37℃、5％C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，72h后全量換液以去除非貼壁細(xì)胞，然后按實(shí)驗(yàn)分組分別加入bFGF(20ng/mL)、EGF(20ng/mL)、bFGF+EGF(均為20ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)觀察。每日取三個(gè)培養(yǎng)孔的細(xì)胞，混合后吸管吹打均勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，取均值。連續(xù)觀察18d。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。Nestin及CD133作為免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定NSCs的細(xì)胞標(biāo)志。結(jié)果表明，

10、原代培養(yǎng)第6d，部分細(xì)胞即表現(xiàn)為Nestin及CD133抗原陽(yáng)性，此后實(shí)驗(yàn)組(bFGF+EGF組)及對(duì)照組(不加細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子組)細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始明顯擴(kuò)增，但實(shí)驗(yàn)組增殖更為明顯，bFGF+EGF組從第8d時(shí)的(96.30±8.78)×104/mL增加到第18d時(shí)的(1407.90±26.62)×104/mL，并且增殖開(kāi)始的時(shí)間較對(duì)照組提前2d。。 3.BMSCs-D-NSCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞分化條件的實(shí)驗(yàn)研究： 本部

11、分實(shí)驗(yàn)旨在比較不同神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)BMSCs-D-NSCs的促分化作用。通過(guò)比較血清、維甲酸(RetinoicAcid，RA)、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GlialCellline-DerivedNeurotrophicFactor,GDNF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BrainDerivedNeurotrophicFactor,BDNF)及2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-ME)等不同濃度誘導(dǎo)條件下BMSCs-D-NSCs

12、分化情況，來(lái)探索BMSCs誘導(dǎo)分化為NSCs及成熟神經(jīng)系細(xì)胞的條件。對(duì)所提取的BMSCs懸液按0.5×106/mL接種于24孔培養(yǎng)板中，加10％胎牛血清，在37℃、5％C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，72h換液去除非黏附細(xì)胞后每孔加入神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基1mL、bFGF20ng、EGF20ng；連續(xù)培養(yǎng)觀察、記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每3～4d半量換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)5～7d，待細(xì)胞大量克隆增殖后進(jìn)行1：2傳代，然后按實(shí)驗(yàn)分組(RA組、R

13、A+BDNF組、RA+GDNF組、RA+BDNF+GDNF組、不同血清濃度組、2-ME組)加入誘導(dǎo)因子，在不同血清濃度(0，2.5％，5％，10％)條件下誘導(dǎo)96h。2-ME組則于傳代后，在10％血清、1mmol/L2-ME濃度條件下預(yù)誘導(dǎo)24h，然后換用2mmol/L的2-ME和無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)7h。用Nestin、CD133抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定NSCs，以NSE、β-tublin鑒定神經(jīng)元，用GFAP鑒定神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果表

14、明，培養(yǎng)第8天，多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出Nestin及CD133抗原陽(yáng)性，即為NSCs細(xì)胞；RA+GDNF組及RA+BDNF+GDNF組在加入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)后3天即有神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn)，此后神經(jīng)元樣細(xì)胞逐漸增多。多種促分化條件均可促使NSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，但是與其它培養(yǎng)條件相比較，低濃度血清(2.5％)+RA+GDNF組誘導(dǎo)分化效能最高，細(xì)胞活力最好。 4.BMSCs-D-NSCs及所其分化神經(jīng)元樣細(xì)胞的電生理特性檢測(cè)：

15、 本部分實(shí)驗(yàn)的目的是體外誘導(dǎo)BMSCs分化為NSCs及成熟神經(jīng)元樣細(xì)胞之后，以膜片鉗鑒定其電生理功能。實(shí)驗(yàn)以恒河猴骨髓中分離出的BMSCs為研究對(duì)象，利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等)對(duì)BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞類型。膜片鉗全細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)未分化細(xì)胞和分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞的電生理特性并進(jìn)行比較分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)方法，以P-Clampfit8.01和S

16、PSS10.0軟件進(jìn)行分析。結(jié)果提示，分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞與未分化細(xì)胞相比，膜特性有了顯著改變，細(xì)胞的靜息膜電位在分化前為-30.62±4.66mv，而分化后為-50.65±6.73mv，兩者之間的差異有顯著性意義(P＜0.01)；未分化細(xì)胞膜電容為16.80±2.95pF，分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞為30.18±6.92pF，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。部分形態(tài)成熟的神經(jīng)元樣細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)敏感的快速激活、快速失

17、活的電壓依賴性的Na+通道，其電流的峰值強(qiáng)度為1098.2±182.4pA；而未分化細(xì)胞卻未能記錄到內(nèi)向電流。表明分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了質(zhì)的變化，從原來(lái)不具備電壓依賴性快速Na+通道的非興奮性細(xì)胞分化為具有電壓依賴性快速Na+通道的興奮性細(xì)胞。盡管兩類細(xì)胞均可記錄到外向的K+電流，但分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞的電流峰值要明顯高于未分化細(xì)胞，說(shuō)明分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞膜上有效的K+通道數(shù)量明顯增多，同時(shí)也可以解釋分化后細(xì)胞靜息膜電位的增加(負(fù)值

18、增高)。 三.結(jié)論BMSCs在一定的培養(yǎng)條件下可以分離培養(yǎng)出NSCs，bFGF與EGF聯(lián)合應(yīng)用能夠促進(jìn)NSCs增殖時(shí)間提前及增殖效能顯著提高；RA+GDNF及配合使用低濃度血清能夠有效誘導(dǎo)骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞向成熟神經(jīng)細(xì)胞分化，且分化細(xì)胞具有快速激活、快速失活的電壓依賴性Na+通道，類似神經(jīng)細(xì)胞的電生理特性。實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs-D-NSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞不僅在形態(tài)學(xué)和免疫原性上具備了神經(jīng)細(xì)胞的特征，而且具有了神經(jīng)細(xì)胞的部分電