基于微電極陣列與原子力顯微鏡聯(lián)合的細胞生理活動多參數(shù)檢測技術的研究.pdf

1、電活動和力學活動在可興奮細胞如心肌細胞和骨骼肌細胞的生理功能中扮演著重要角色。本文以心肌細胞為例來研究能夠同時記錄細胞電活動和力學活動的電機械信號檢測方法。在心肌細胞中，電生理活動和力學活動是緊密關聯(lián)的。心肌細胞產(chǎn)生動作電位的過程使胞內(nèi)鈣離子濃度迅速增大，鈣離子直接參與到心肌細胞的收縮活動中。另外，心肌細胞的力學活動對其電生理活動具有反饋作用。心肌細胞的收縮張力會對肌絲的鈣離子敏感性以及細胞膜上的機械敏感性離子通道產(chǎn)生影響，從而影響心肌

2、細胞的電活動。對心肌細胞的電活動和力學活動同時進行檢測有助于了解心肌細胞在生理和病理狀態(tài)下的工作機制。
　　一方面，心肌細胞電機械活動的檢測可以更全面地考察心血管藥物的作用效果，為藥物篩選提供一種高效的手段。細胞在藥物作用下的電生理活動參數(shù)如電發(fā)放頻率和動作電位時間長度的變化已經(jīng)成為評價藥物作用的指標。與此同時，心肌細胞的力學活動參數(shù)如收縮力的大小和收縮——舒張周期的長短也被用于藥效評價。對于一些藥物來說，在其濃度較低的情況下，心

3、肌細胞的電生理活動變化不明顯而力學活動則明顯增強。將細胞的電活動檢測與力學測量相結合有助于提高藥效評估的準確性和效率。
　　另一方面，心肌細胞的數(shù)學模型為深入理解心肌細胞的工作機制提供了有力工具，并且在虛擬教學、疾病治療效果的評價等方面有廣闊的應用前景。較早發(fā)展起來的心肌細胞電生理模型主要在細胞膜離子學說基礎上描述心肌細胞動作電位的產(chǎn)生過程。另外，描述心肌細胞力學活動的數(shù)學模型也被建立起來。以上兩種模型在心肌細胞研究中都具有重要價

4、值。然而，僅僅針對心肌細胞電活動和力學活動之一進行建模不能完全反映心肌細胞的生理功能。為此，有研究者將上述兩種模型結合起來建立了心肌細胞的電機械模型。這種模型的建立和完善需要大量的同時包含細胞電學和力學信息的實驗數(shù)據(jù)，而細胞電機械信號檢測方法可以為數(shù)據(jù)采集過程提供支持。
　　由于以上兩方面的原因，發(fā)展一種高效的細胞電機械信號檢測方法是一項很有意義的工作。本文提出了一種結合微電極陣列電信號采集技術與原子力顯微鏡力學測量技術為一體的細

5、胞電機械信號檢測方法，并驗證了該方法的有效性。本文的主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)描述了細胞電活動和力學活動產(chǎn)生的結構基礎，介紹了神經(jīng)細胞和心肌細胞動作電位的產(chǎn)生過程和各自的特點，分析了心肌細胞的電力學耦合機制，最后闡述了細胞電機械信號檢測方法研究的意義和重要性。
　　(2)回顧了現(xiàn)有的細胞電生理信號和力學信號檢測技術，介紹了微電極陣列胞外電信號采集技術的發(fā)展和應用，另外還對原子力顯微鏡這一力學測量工具的原理、發(fā)展過程和生物

6、學應用進行了敘述。
　　(3)以神經(jīng)細胞為研究對象，利用微電極陣列對可控生長的嗅球神經(jīng)細胞網(wǎng)絡進行電信號采集。首先，制作了一種帶有微結構的細胞培養(yǎng)器件并對器件表面進行改性處理。將嗅球神經(jīng)細胞培養(yǎng)在該器件上，通過微結構和器件表面特性來控制神經(jīng)細胞的生長，從而形成具有固定連接方式的細胞網(wǎng)絡。對網(wǎng)絡中的嗅球神經(jīng)細胞進行了免疫化學鑒定。通過將細胞培養(yǎng)器件與微電極陣列相結合采集了網(wǎng)絡中神經(jīng)細胞的電信號。分析了實驗結果和實驗中存在的問題。

7、r>　　(4)采用原子力顯微鏡對神經(jīng)活動誘導的細胞形態(tài)學變化進行檢測。搭建了細胞力學檢測平臺。為了驗證這一平臺在活細胞檢測中的可行性，以大鼠皮層神經(jīng)元的可塑性為考察對象，分析了以往研究中神經(jīng)細胞刺激方法和形態(tài)學檢測手段的不足，提出了將光解籠鎖刺激和原子力顯微鏡掃描成像結合起來檢測神經(jīng)活動導致的細胞結構變化這一方法。觀察了不同條件下解籠鎖藥物分子的作用區(qū)域隨時間的變化情況，確定了合適的刺激參數(shù)。分別對不同條件下的4組神經(jīng)細胞進行了測試。對

8、實驗結果和實驗過程的優(yōu)缺點進行了分析和討論。
　　(5)將微電極陣列與細胞力學測量平臺相結合，對心肌細胞的電機械活動進行檢測。介紹了心肌細胞電機械信號檢測的研究背景，描述了現(xiàn)有的細胞電機械信號檢測方法，分析了這些方法的不足，提出將微電極陣列與原子力顯微鏡相結合的實驗方案。在微電極陣列芯片上培養(yǎng)心肌細胞。利用微電極陣列和原子力顯微鏡的聯(lián)合平臺，同時記錄了心肌細胞的電生理活動和力學活動。分析了心肌細胞電信號和力學信號的關聯(lián)。為了驗證實

9、驗平臺在藥物篩選中的有效性，記錄了心肌細胞在腎上腺素等藥物作用前后的電機械活動。通過對細胞電發(fā)放間隔時間和橫向力大小的分析考察了藥物作用效果。測定了心肌細胞收縮力和刺激頻率關系曲線。討論了實驗結果和實驗過程的不足。
　　在本文提出的檢測平臺的基礎上，一些細胞生物學中的基本問題可以得到深入研究。多個心肌細胞如何通過力學或者電學信號的感知來實現(xiàn)一致的生理活動節(jié)律是一個有趣的課題。通過AFM探針對心肌細胞施加特定大小的作用力并采用MEA

10、記錄細胞電生理信號，我們可以研究作用力的大小與細胞靜息電位、復極化時間之間的定量關系。利用AFM探針對心肌細胞施加頻率和大小可控的力學刺激，可以使細胞的生理活動節(jié)律最終與力學刺激的頻率一致。在這個過程中，研究者可考察力學刺激幅值、作用的時間模式對生理活動的影響。將心肌細胞培養(yǎng)在彈性模量不同的基底材料上，通過細胞電機械活動的長時間記錄來探究心肌細胞的力學環(huán)境對其特定基因表達、蛋白合成和收縮——舒張功能的影響。同樣，如果對心肌細胞施加持續(xù)的

11、變化的電場，我們同樣可以研究電場變化對心肌細胞生理活動的影響。單純的心肌細胞培養(yǎng)體系和心肌細胞——成纖維細胞共培養(yǎng)兩種體系中，細胞的電機械活動特征（收縮頻率、收縮力大?。┦欠癫煌?，導致這些差異的分子機制也可以通過本文提出的細胞檢測平臺進行探索。有研究表明心臟中間層細胞和心臟內(nèi)層細胞具有不同的生理特性，如果將心臟中不同部位的細胞準確區(qū)分并分別進行培養(yǎng)，利用細胞電機械測量平臺對這些細胞的電機械特性進行定量表征，將所得數(shù)據(jù)用于心臟數(shù)學模型的構

12、建，那么，這些模型對心臟在生理或者病理狀態(tài)下的活動情況可能給出更精確的描述。利用本文提出的細胞電機械活動檢測平臺，我們可以將細胞電學特性（細胞膜的電容、電阻等）測試和力學特性（彈性模量等）測試相結合，從而對正常細胞和腫瘤細胞進行鑒別，為癌癥的診斷、治療和療效評估提供可能的途徑。
　　本文提出的實驗平臺具有對單個細胞同時施加力學、電學和生物化學刺激的能力。最近的研究表明機械刺激可以影響細胞微環(huán)境，誘導干細胞分化，影響細胞形態(tài)和肌動蛋