納米二氧化硅與碳納米管典型生物毒性效應(yīng)研究.pdf

1、隨著納米科技的迅速發(fā)展和納米材料的廣泛應(yīng)用，人們在社會生產(chǎn)和日常生活中對各種納米材料的暴露機會日益增多。由于納米顆粒具有特殊的理化性質(zhì)，可能產(chǎn)生與常規(guī)物質(zhì)不同的生物學(xué)效應(yīng)。因此，納米材料的生物安全性問題受到廣泛關(guān)注。本課題選擇應(yīng)用廣泛的兩種納米材料：納米二氧化硅(nm-Si02)和碳納米管(CNTs)，分別研究其生殖毒性和肝腎毒性效應(yīng)。
　　 納米SiCh是目前世界上規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)產(chǎn)量最高的一種納米粉體材料，其產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于化

2、工材料以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。以石英為代表的微米級結(jié)晶型Si02已被證實對人體有很大危害。納米Si02的安全性研究也引起了人們的重視，目前關(guān)于納米Si02的生物安全性研究的報道，主要集中于對呼吸系統(tǒng)的整體及細(xì)胞毒性的作用，關(guān)于納米Si02對生殖功能損傷作用的報道較少。
　　 碳納米管是最早進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的一種納米材料，在日常生活和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用。關(guān)于CNTs的毒性效應(yīng)的研究較為全面和深入，但應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究

3、CNTs肝腎毒性效應(yīng)的報道較少。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展起來的一種組學(xué)技術(shù)，可以用于研究化學(xué)物引起的內(nèi)源性代謝物變化，能夠直接地反映體內(nèi)生化狀態(tài)的改變。
　　 本課題第一部分，研究納米Si02對雄性大鼠的生殖功能的損傷效應(yīng)，并與微米粒徑Si02比較，探討顆粒粒徑對毒性效應(yīng)的影響；第二部分，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究CNTs對雄性大鼠的肝腎毒性作用及機制。為納米Si02和CNTs的安全性評價提供實驗依據(jù)。
　　 1．

4、納米二氧化硅對雄性大鼠生殖毒性效應(yīng)研究：
　　 選取納米二氧化硅(nm-Si02)和微米二氧化硅(μm-SiOz)，用生理鹽水制備染毒懸液，氣管滴注法染毒雄性Wistar大鼠。大鼠隨機分為5組：生理鹽水對照組、高低劑量nm-Si02組、高低劑量μm-Si02組。高劑量組為7.5mg/kgBW，低劑量組為1.5mg/kgBW，隔日染毒1次，共染毒5周。
　　 (1)觀察染毒對大鼠附睪精子的影響。精子評價是分析雄性生殖功能的

5、重要指標(biāo)。結(jié)果顯示，對照組相比，高低劑量nm-Si02組及高劑量μm-Si02組精子數(shù)量均顯著降低；高劑量nm-Si02組及高劑量μm-Si02組精子活動率降低；各染毒組精子畸形率均降低。提示染毒造成了精子功能障礙，并且影響了精子的發(fā)生和成熟。在低劑量水平，nm-Si02較μm-Si02損傷更為嚴(yán)重。
　　 (2)觀察了染毒后大鼠睪丸組織及肺組織形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果顯示大鼠睪丸組織形態(tài)基本正常，大鼠肺組織產(chǎn)生炎癥損傷。說明染毒尚未

6、對睪丸組織造成實質(zhì)性損傷。
　　 (3)觀察染毒對大鼠生殖功能相關(guān)激素和酶的影響。染毒后，與對照組相比，高低劑量nm-Si02組及高劑量μm-Si02組血清及組織中睪酮(T)含量均顯著降低；高劑量nm-Si02組及高劑量μm-Si02組卵泡刺激素(FSH)含量升高。說明睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞功能受到損傷，影響了激素的合成和分泌，干擾了下丘腦-垂體-睪丸軸(hypothalamic-pituitary-testicularaxis

7、，HPTA)的調(diào)節(jié)作用。同時，睪丸組織中睪丸功能標(biāo)志酶的活性也發(fā)生了改變：高劑量nm-Si02組乳酸脫氫酶(LDH)、高劑量nm-Si02組及高劑量μm-Si02組琥珀酸脫氫酶(SDH)活性均降低，提示染毒影響了精子線粒體的功能。
　　 (4)檢測睪丸組織以及血清中氧化損傷指標(biāo)的變化。關(guān)于綱米材料所產(chǎn)生的生物效應(yīng)機制，目前主要關(guān)注的是氧化應(yīng)激作用。本實驗中，與對照組相比，染毒后高劑量nm-Si02組及高劑量μm-SiO2組(MD

8、A)含量升高；高劑量nm-Si02組超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力降低。說明Si02對大鼠睪丸組織產(chǎn)生氧化損傷作用，進而破壞了睪丸和附睪的結(jié)構(gòu)，對精子造成損傷并導(dǎo)致生精功能的障礙。
　　 (5)對睪丸細(xì)胞進行了流式細(xì)胞分析，檢測生精細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞類型的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，染毒后高低劑量nm-Si02組及高劑量μm-Si02組細(xì)胞凋亡率升高；同時高低劑量nm-Si02組及高劑量μm-S

9、i02組單倍體細(xì)胞減少，四倍體細(xì)胞增加；高劑量nm-Si02組及高劑量pm-Si02組G0/G1期細(xì)胞比例減小，G2/M期細(xì)胞比例增大。說明Si02可能對大鼠生精細(xì)胞的有絲分裂產(chǎn)生抑制作用，阻滯了細(xì)胞周期進程，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡。
　　 (6)雄鼠染毒后與正常成年雌鼠按1:2合籠交配，于妊娠第20天各組處死一半雌鼠，檢查胎鼠情況；另一半雌鼠自然分娩，檢查仔鼠情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，染毒后高低劑量nm-Si02組大鼠交配率及所

10、產(chǎn)胎鼠數(shù)量顯著降低，各組胎鼠及仔鼠生長發(fā)育指標(biāo)無顯著差異。說明納米Si02對雄性大鼠染毒影響了大鼠交配及胚胎形成，可以影響動物交配以及胚胎形成，但對于成功受孕后的胎鼠影響不明顯。
　　 實驗結(jié)果說明Si02染毒后對大鼠睪丸組織造成了氧化損傷作用，影響了生殖器官的結(jié)構(gòu)、代謝，從而改變精子生存的內(nèi)環(huán)境，并且影響了性激素的合成和分泌，損傷生精細(xì)胞，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡。本實驗條件下，在高劑量水平，nm-Si02與μm-Si02均造成各指標(biāo)

11、的改變，但在低劑量水平時，與μm-Si02相比，nm-Si02表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的損傷作用。
　　 2．應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究CNTs對大鼠的肝腎毒性作用
　　 用生理鹽水制備CNTs染毒懸液，氣管滴注法染毒雄性Wistar大鼠。大鼠隨即分為四組，高劑量組為22.5mg/kgBW，中劑量組為15Mg/kgBW，低劑量組為7.5mg/kgBW，生理鹽水作為對照組。每日染毒1次，連續(xù)染毒15次。
　　 (1)大鼠肝腎功能相

12、關(guān)生化指標(biāo)檢測及肝腎組織學(xué)觀察。染毒后與對照組相比，高劑量組白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)含量均顯著降低；中劑量組TP含量顯著降低；低劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量顯著降低。各組尿酸(UA)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)含量無顯著差異。各組大鼠肝臟病理切片觀察，各染毒組可見小灶性炎細(xì)胞，肝細(xì)胞脂肪變性，高劑量組可見部分肝細(xì)胞腫脹，肝灶性壞死。各組大鼠腎臟病理切片未見明顯異常改變。
　　 (2)觀察大鼠尿

13、液代謝表型的變化。染毒后收集24h尿液，制備分析樣品，運用NMR測定1H核磁共振譜，對數(shù)據(jù)進行積分后采用PLS-DA分析法進行分析。結(jié)果表明，CNTs染毒后大鼠尿液代謝組在得分圖中呈聚類型分布，說明在CNTS的作用下，大鼠尿液代謝組模式出現(xiàn)了顯著變化。與對照組相比，染毒組乙酸和氧化三甲胺的濃度增加，幾種三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物（2-酮戊二酸、琥珀酸、檸檬酸）和肌酐濃度降低。
　　 (3)觀察大鼠血漿代謝表型的變化。結(jié)果表明，CNTs染

14、毒后大鼠血漿代謝組在得分圖中呈聚類型分布，說明在CNTs的作用下，大鼠血漿代謝組模式出現(xiàn)了顯著變化，與對照組相比，染毒組乳酸、膽堿、0-乙酰糖蛋白含量升高，而血糖、血脂、低密度脂蛋白含量降低。說明CNTs染毒后肝臟糖酵解過程加強，肝臟脂肪酸β氧化過程產(chǎn)生的乙酰CoA不能完全進入三羧酸循環(huán)氧化產(chǎn)能，從而轉(zhuǎn)向生成酮體。
　　 (4)觀察大鼠肝組織代謝表型的變化。結(jié)果表明，CNTs染毒后大鼠肝臟代謝組在得分圖中呈聚類型分布，但高劑量組

15、和低劑量組基本重合。說明在CNTs的作用下，大鼠尿液代謝組模式出現(xiàn)了顯著變化，但劑量效應(yīng)并不明顯。與對照組相比，染毒組乳酸、糖和糖原、多不飽和脂肪酸含量降低；TMAO、膽堿、磷酸膽堿含量升高。
　　 (5)觀察大鼠腎組織代謝表型的變化。結(jié)果表明，CNTs染毒后大鼠腎臟代謝組在得分圖中呈聚類型分布，說明在CNTs的作用下，大鼠尿液代謝組模式出現(xiàn)了顯著變化，與對照組相比，染毒組乳酸、TMAO、甜菜堿、膽堿和磷酸膽堿以及多不飽和脂肪酸