斜紋夜蛾核多角體病毒誘導細胞凋亡的研究.pdf

1、桿狀病毒感染昆蟲細胞可誘導細胞凋亡(apoptosis)，細胞凋亡作為一種宿主范圍決定因子限制了桿狀病毒的殺蟲范圍，影響桿狀病毒殺蟲劑在生物防治中的應用：然而，在長期進化過程中，桿狀病毒獲得了抗凋亡基因以阻止細胞凋亡，使其能夠正常復制。在已測序的桿狀病毒中絕大部分都包含兩個或兩個以上的抗凋亡基因，但是部分體外實驗結果表明，并不是所有抗凋亡基因都具有抗細胞凋亡活性。本研究首次利用RN Ai技術對斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodoptera

2、litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)中兩個抗凋亡基因Splt-iap4和Splt-p49在SpltNPV受納宿主中的抗凋亡功能進行研究，通過瞬時表達檢測探討兩個基因在SpltNPV非受納宿主中的抗凋亡功能，同時對抗凋亡基因與其宿主的進化關系進行了初步探討。主要結果如下： PCR擴增得到Splt-p49基因和Splt-iap4基因，分別將其連接到含有兩個反向T7啟動子的質粒載體上，體外轉錄得到大

3、片段的雙鏈RNA (double strain RNA，dsRNA)，將dsRNA分別或同時轉染至被SpltNPV病毒感染的SpLi-221細胞以沉默Splt-iap4或Splt-p49，或者同時沉默Splt-iap4和Splt-p49的轉錄。經光學顯微鏡觀察、DNA ladder檢測、細胞存活率計算以及病毒滴度測定，結果說明SpltNPV感染SpLi-221細胞時，Splt-P49具有抗凋亡功能，而Splt-IAP不具有這種功能。但實

4、驗中發(fā)現，SpltNPV感染SpLi-221細胞在48 h之前細胞會聚集成團，而勛Splt-iap4dsgNA處理細胞未出現此現象，大部分依然是獨立的單個細胞，推斷Splt-lap4基因在病毒感染期間起到了某種作用使得細胞的聚集受阻，但Splt-iap4的功能與病毒產生可感染性的子代病毒無關。 在vAcAnh感染Sf9系統(tǒng)中，分別瞬時表達Splt-iap4和Splt-p49兩基因，經光學顯微鏡和細胞存活率計算方法檢測，結果同樣顯

5、示Splt-P49具有抗凋亡功能而Splt-IAP不具有抗凋亡功能，且Splt-IAP無輔助抗凋亡功能或延遲細胞凋亡功能。最后對桿狀病毒中的抗凋亡基因與其來源宿主進行進化分析，結果顯示親緣關系相近的桿狀病毒所含的抗凋亡類型也相近，說明抗凋亡基因與桿狀病毒進化有著密切的關系，也可能發(fā)揮著重要作用。 斜紋夜蛾(Spodoptera litura)和甜菜夜蛾(S. exigua)同屬夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬的昆蟲，親緣關

6、系很近．且SpltNPV和甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)基因組相似性很高，但這兩種病毒并不能交叉感染各自宿主。本文從細胞水平和亞顯微水平對SpltNPV感染非受納宿主離體細胞Se301的過程進行了描述，并對感染失敗的原因進行了初步的生化分析。 光學顯微鏡顯示，被SpltNPV感染的Se301細胞在感染后24 h至120 h期間細

7、胞出現了明顯的病理現象，包括細胞空泡，細胞聚集等，且隨著時間的延長病理癥狀越來越嚴重，但感染細胞中始終沒有病毒多角體。DAPI染色熒光觀察和電鏡觀察結果，都表明從24 h至120 h各樣品中均顯示細胞出現了早期凋亡的特征，但未形成晚期凋亡特征的凋亡小體。TCID50檢測表明病毒沒有產生有感染性的芽生型子代病毒。Dot blotting顯示，在被感染的Se301細胞中可完成病毒DNA的復制；RT-PCR分析也顯示，感染細胞72 h時，Sp