FUNCTIONAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF BOVINE HERPES VIRUS--1(BoHV--1)pUL21.pdf

1、牛皰疹病毒1型(BoHV1)屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，是有囊膜的雙鏈DNA病毒，該病毒可導(dǎo)致牛呼吸道疾病、陰道炎、流產(chǎn)、結(jié)膜炎、包皮炎和嚴(yán)重的初生牛疾病。BoHV1型病毒可感染所有年齡段和世界各品種的牛，對全球養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。和所有的皰疹病毒一樣，成熟的BoHV-1病毒顆粒包括多層結(jié)構(gòu):含雙鏈DNA基因組的核衣殼，囊膜以及外皮層。外皮層位于囊膜和核衣殼之間，由蛋白簇聚集而成。所有的α-皰疹病毒具有15個以上的核衣殼蛋白。在病

2、毒顆粒產(chǎn)生早期，這些蛋白的功能表現(xiàn)在調(diào)節(jié)病毒粒子早期基因的表達(dá);在病毒感染的晚期，這些蛋白參與病毒的形成、組裝和分泌。此外，該類蛋白參與包裝、去包裝、再包裝等各個過程。BoHV-1病毒外層蛋白的研究還未闡明。僅有少量外層蛋白進(jìn)行了詳細(xì)研究，然而大部分BoHV-1病毒外層蛋白的功能與相互作用仍然未闡明。
　　經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)UL21是α皰疹病毒亞科中的多功能保守的外層蛋白，該蛋白包括575個氨基酸。pUL21的功能僅在單純皰疹病毒(H

3、SV)和偽狂犬病毒(PRV)得到驗證，然而BoHV1的UL21蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中的表型尚未闡明。因此，本研究旨在確定UL21在BoHV1中的功能。主要取得如下研究結(jié)果:
　　1.UL21缺失突變病毒構(gòu)建研究
　　利用細(xì)菌人造染色體系(BAC)構(gòu)建了UL21缺失突變病毒(vBoHV-1△UL21)及UL21基因回復(fù)病毒(△UL21R)。一步法生長曲線結(jié)果顯示:在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中48h，vBoHV-1△UL21的增殖比野生型毒

4、株少1000倍，其空斑直徑比野生型毒株的小85％。相比之下，vBoHV-1、△UL21R和BoHV-1UL21HA的病毒滴度相似。此外，UL21突變病毒的斑塊大小也比其他病毒嚴(yán)重降低。UL21突變體的斑塊大小幾乎為野生型和反向病毒的85％。雖然斑塊大小BoHV-1、vBoHV-1-△UL21R和vBoHV-1-UL21-HA病毒沒有顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明HA標(biāo)記不會干擾UL21的功能，而且UL21對病毒粒子的細(xì)胞質(zhì)出芽至關(guān)重要。

5、　　2.UL21蛋白對病毒核出芽的影響研究
　　為了研究UL21蛋白的特性，利用BAC重組技術(shù)將HA標(biāo)簽與UL21基因融合。經(jīng)細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)UL21主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在胞核內(nèi)僅有點(diǎn)狀分布。
　　進(jìn)一步探索UL21在出芽途徑中的作用，將HA標(biāo)簽與UL21突變株和野毒株的核衣殼蛋白UL35分別融合表達(dá)，再經(jīng)免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)pUL21的突變不影響核衣殼的釋放。同時，利用透射電鏡對UL21缺失病毒以及野生型病毒進(jìn)行了觀察，結(jié)果

6、發(fā)現(xiàn)UL21缺失病毒以及野生型病毒感染細(xì)胞后，核衣殼總數(shù)無顯著性差異。這一結(jié)果支持了我們前期的發(fā)現(xiàn)，UL21缺失病毒并不影響核衣殼的排出。超微結(jié)構(gòu)證實(shí)UL21缺失導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中部分有包膜和無包膜病毒粒子聚集，而成熟病毒粒子數(shù)量減少。由于大量的衣殼蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累，導(dǎo)致衣殼充分包裹，使UL21缺失病毒表現(xiàn)出次囊膜形成受阻。此外，TEM定量分析細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞核中病毒顆粒的核衣殼總數(shù)無顯著差異;而與野生型或vBoHV-1-△

7、UL21R病毒相比，vBoHV-1△UL21感染細(xì)胞后，胞質(zhì)中有包膜病毒顆粒數(shù)量減少了約80％，胞外釋放的成熟病毒粒子的數(shù)量減少了約90％。
　　3.UL21互作蛋白研究
　　利用質(zhì)譜分析篩選并鑒定UL21的互作蛋白。將HA標(biāo)簽蛋白進(jìn)行免疫沉淀，取目的帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的蛋白質(zhì)是UL21，而HA標(biāo)記的UL21與UL16共沉淀，并經(jīng)免疫熒光技術(shù)證實(shí)，這兩種蛋白質(zhì)形成了復(fù)合物。
　　總之，本研究提供了證據(jù)，pUL