蘋果樹腐爛病菌木聚糖酶基因的克隆及功能分析.pdf

1、蘋果樹腐爛病菌（Valsa mali var. mali），是蘋果樹上一種具有毀滅性的子囊菌類病原真菌，其在植物體內(nèi)可分泌木聚糖酶、纖維素酶和果膠酶等，來降解植物細(xì)胞壁促進(jìn)病原菌侵入寄主體內(nèi)。該病菌引起的蘋果樹腐爛病在中國已造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，由于缺乏對其致病基因和致病機(jī)理的了解，導(dǎo)致腐爛病尚無法得到有效控制。前期研究表明，腐爛病菌分泌的木聚糖酶是其關(guān)鍵致病因素之一。為了更好地了解木聚糖酶在腐爛病菌致病性中的作用，我們克隆了兩個木聚糖

2、酶基因Xylanase I和Xylanase II，對兩個基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，并對基因進(jìn)行了敲除，初步驗證了基因功能。
　　兩個木聚糖酶基因的序列分析結(jié)果顯示，Xylanase I的cDNA包含5’端和3’端全長為1626 bp，開放閱讀框為1320 bp，編碼蛋白的相對分子量為43.8 kDa，等電點為4.4。根據(jù)其氨基酸序列比對顯示，其與糖基水解酶10家族有很大的同源性。根據(jù)已知10家族XynAS9的晶體蛋白結(jié)構(gòu)，預(yù)測了

3、Xylanase I假定蛋白的3D結(jié)構(gòu)，在空間結(jié)構(gòu)上呈“碗狀”，第149位和256位谷氨酸殘基被認(rèn)定為催化區(qū)域。Xylanase II的cDNA包含5’端和3’端全長為969 bp，開放閱讀框為681 bp，編碼蛋白的相對分子量為23.8 kDa，等電點為5.29。根據(jù)其氨基酸序列比對顯示，其與糖基水解酶11家族有很大的同源性。根據(jù)已知11家族Xylanase11C的晶體蛋白結(jié)構(gòu)，預(yù)測了Xylanase II假定蛋白的3D結(jié)構(gòu)，在空間結(jié)

4、構(gòu)上呈“右手半握狀”，第122位和第213位谷氨酸殘基被認(rèn)定為催化區(qū)域，第113位和第124酪氨酸氨基酸殘基被認(rèn)定為底物結(jié)合區(qū)域。
　　構(gòu)建了兩個木聚糖基因的重組表達(dá)載體pET-Xylanase，并對其原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。Xylanase I重組蛋白的最佳表達(dá)條件為：0.5 mmol/L IPTG在30℃誘導(dǎo)12 h。Xylanase II重組蛋白的最佳表達(dá)條件為：0.1 mmol/L IPTG在15℃誘導(dǎo)10 h，且上清中有

5、可檢測到木聚糖酶活性的可溶性蛋白。通過Western blot技術(shù)對重組表達(dá)蛋白進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示分別在63 kDa和42 kDa有特異蛋白條帶。
　　利用熒光定量RT-PCR技術(shù)，對離體培養(yǎng)基和蘋果枝條中的兩個木聚糖酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蘋果枝條提取物和燕麥木聚糖作為唯一碳源，在較高溫度下（25~30℃）均可誘導(dǎo)Xylanase I和Xylanase II的表達(dá)，而添加葡萄糖作為唯一碳源，僅誘導(dǎo)

6、了Xylanase I的表達(dá)。腐爛病菌在對蘋果離體枝條和愈傷組織的侵染過程中，Xylanase I和Xylanase II的表達(dá)量顯著升高且一直持續(xù)表達(dá)，暗示兩個木聚糖酶基因在腐爛病菌的致病性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　在上述研究基礎(chǔ)上，對蘋果樹腐爛病菌的木聚糖酶基因Xylanase I進(jìn)行了敲除，以進(jìn)一步驗證其基因功能。利用Double-joint PCR將標(biāo)記基因與目的基因上下游連接，構(gòu)建基因敲除盒。通過 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

7、法對目的基因進(jìn)行敲除，獲得139個敲除突變體。對突變體進(jìn)行 PCR檢測，僅獲得1個 Xylanase I基因的敲除突變體。對Xylanase I基因敲除突變體進(jìn)行生物學(xué)特性和致病性檢測，發(fā)現(xiàn)敲除突變體在菌落顏色、菌落形態(tài)、菌落生長速度與野生型菌株LXS080901相比，均沒有明顯差異，但將敲除突變體接種蘋果離體枝條，發(fā)現(xiàn)其致病力與野生型菌株LXS080901相比，顯著降低；測定發(fā)病組織中木聚糖酶活性發(fā)現(xiàn)，敲除突變體產(chǎn)生的木聚糖酶活性明顯