重組融合蛋白SAK-HV降脂機制研究.pdf

1、脂代謝紊亂是心腦血管疾病和代謝綜合征的病理基礎(chǔ)。特別是脂質(zhì)在血液和肝臟中的過多積累會導致高脂血癥和非酒精性脂肪肝的形成，在全世界范圍內(nèi)嚴重影響人類健康。我實驗室在國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目（2009ZX09103-623，2012ZX09102301-017）的資助下研制開發(fā)了抗動脈粥樣硬化（AS）的新型重組融合蛋白SAK-HV。SAK-HV由SAK突變體、RGD序列和水蛭素C端12肽構(gòu)成，具有溶栓、抗凝和抑制血小板聚集的復合功能

2、；在多種AS動物模型中均發(fā)揮了良好的抗AS療效。同時，我們發(fā)現(xiàn)SAK-HV可顯著地降低血膽固醇和甘油三酯水平，并明顯改善肝臟脂肪沉積。特別是在給藥14-21天觀察期內(nèi)，SAK-HV降低膽固醇的效果顯著優(yōu)于上市藥物阿托伐他汀。本研究深入探索SAK-HV降脂機制，并在體外實驗過程中意外發(fā)現(xiàn)其對巨噬細胞具有促增殖作用。因此，本研究分為兩個部分：第一部分作為研究主體深入探索SAK-HV降脂機制，為治療高脂血癥和非酒精性脂肪肝提供新靶點和新思路；

3、第二部分作為拓展研究初步闡明SAK-HV促巨噬細胞增殖機制，為進一步了解SAK-HV的藥物機制奠定了基礎(chǔ)。
　　第一部分 SAK-HV降脂機制研究
　　本研究第一部分結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析以及一系列體內(nèi)外實驗深入研究該蛋白降脂機制。量效分析表明，SAK-HV在高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠中降血脂量效關(guān)系呈現(xiàn)獨特的非劑量依賴的U型曲線。時效分析顯示其降脂效應(yīng)具有延時突發(fā)和迅猛的特性。SAK-HV有效減輕肝臟脂肪沉積，并降低肝、血炎癥，

4、且未造成任何肝臟或出血病變產(chǎn)生。同時，在觀察期14天內(nèi)SAK-HV降脂效果顯著優(yōu)于阿托伐他汀。在較阿托伐他汀具有相似的抗氧化應(yīng)激效果的同時，SAK-HV可以更加有效地改善肝功能指標。
　　由于SAK-HV在肝和血中均可以有效降脂，且肝臟是參與脂代謝的關(guān)鍵器官，我們推測肝臟可能是SAK-HV發(fā)揮降脂效應(yīng)的主要靶器官之一。對ApoE-/-小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組芯片的基因差異表達分析提示SAK-HV誘導補體介導了肝細胞增殖，從而增加能量和物質(zhì)需

5、求，最終造成包括PPAR信號通路激活在內(nèi)的脂代謝改變；并提示PGC-1α可能介導了肝臟類固醇激素合成過程，該過程與降低的血TC存在潛在的關(guān)聯(lián)。權(quán)重基因共表達分析WGCNA挖掘出肝臟中補體介導的STAT3-C/EBPβ-PGC-1α新通路可能構(gòu)成了SAK-HV的一條關(guān)鍵降脂途徑。
　　我們通過一系列體內(nèi)指標檢測驗證并拓展轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果。實驗證實SAK-HV在給藥7~14天之間觸發(fā)了經(jīng)典途徑補體激活；同時激活了潛在降脂新通路STAT3

6、-C/EBPβ-PGC-1α，有效改善肝臟脂肪沉積，并觸發(fā)了適度的肝增殖。另一方面，實驗結(jié)果還顯示肝臟脂肪酸氧化代謝被增強，并證實孕、雌激素合成代謝的增強導致它們在肝臟水平的顯著升高。此外，我們還檢測到SAK-HV增強了肝臟中LDLr介導的膽固醇吸收，且未對膽固醇分解、排泄途徑造成顯著影響。
　　因此，我們初步提出假說：SAK-HV通過耗能的肝細胞增殖降低血脂，肝臟中補體介導的STAT3-C/EBPβ-PGC-1α構(gòu)成了該蛋白一條

7、新穎的降脂通路，其中PGC-1α可能介導了肝臟雌激素胞內(nèi)分泌，在降脂過程中發(fā)揮了潛在的作用。
　　PGC-1α慢病毒敲低抑制了SAK-HV對孕、雌激素合成途徑的增強作用，從而有效阻斷了SAK-HV處理后肝臟中孕、雌激素水平的升高。該結(jié)果證實PGC-1α在肝增殖過程中介導了孕、雌激素的胞內(nèi)分泌。雌激素合成抑制劑來曲唑以及PGC-1α敲低均有效阻斷了SAK-HV促肝增殖效應(yīng)，顯著抑制了SAK-HV降血脂及改善肝臟脂肪沉積的療效。來曲唑

8、部分抑制了SAK-HV增強的PPARα脂肪酸氧化，并阻斷了其通過LDLr介導的肝臟膽固醇吸收。PGC-1α敲低造成了SAK-HV給藥后肝TG水平較模型組的升高，這可能是由于肝臟增殖早期儲能過程中轉(zhuǎn)瞬的肝臟脂肪積累造成的；但是該現(xiàn)象在雌激素抑制實驗中并未發(fā)現(xiàn)，表明PGC-1α在沒有雌激素作用的情況下仍然部分降低了肝TG水平。換而言之，雌激素對PGC-1α介導的降脂作用起到了放大的作用。類似地，PGC-1α敲低幾乎完全抑制了PPARα脂肪酸

9、氧化，而非來曲唑造成的部分抑制，進一步證實了雌激素對PGC-1α誘導的PPARα脂肪酸氧化的放大作用。研究表明PGC-1α-雌激素代謝軸構(gòu)成了肝增殖過程中一個新穎的能量模型。
　　染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP實驗證實SAK-HV處理分別增強了STAT3與C/EBPβ啟動子，以及C/EBPβ與PGC-1α啟動子的結(jié)合；STAT3磷酸化抑制劑STATTIC顯著抑制了SAK-HV潛在降脂新通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α，并有效阻

10、斷了SAK-HV降血脂和改善肝臟脂肪沉積的療效。本研究證實肝臟中STAT3-C/EBPβ-PGC-1α通路構(gòu)成了一條新穎的降脂途徑。
　　已有研究證實補體激活的IL-6-STAT3通路在肝增殖過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其激活水平與肝增殖速率呈正比。我們利用補體抑制劑FUT-175和C3敲除分別有效減弱了SAK-HV處理后ApoE-/-小鼠及C3-/-小鼠血C5a和IL-6的上調(diào)作用，顯著抑制下游STAT3-C/EBPβ-PGC-1α降

11、脂通路，并阻斷了SAK-HV觸發(fā)的肝臟增殖效應(yīng)。補體抑制還破壞了SAK-HV在ApoE-/-小鼠中的降血脂及改善肝臟脂肪沉著的療效。通過SAK-HV在體外刺激小鼠胚胎肝細胞BNL-Cl2，表明脫離了補體激活，SAK-HV處理無法導致BNL-Cl2細胞周期的改變，且無法激活STAT3-C/EBPβ-PGC-1α通路。這些體內(nèi)外結(jié)果充分證實補體在SAK-HV降脂效應(yīng)中的關(guān)鍵作用。已有研究表明PPARα可以介導C3轉(zhuǎn)錄升高。但PGC-1α敲低

12、造成的PPARα抑制在ApoE-/-小鼠中并未顯著影響SAK-HV觸發(fā)的補體激活水平，進一步證明補體激活是SAK-HV觸發(fā)降脂效應(yīng)的原因，而非結(jié)果。
　　綜上所述，第一部分研究證實PGC-1α在肝增殖過程中參與肝臟孕、雌激素合成；并提出補體在肝臟經(jīng)由STAT3-C/EBPβ-PGC-1α新降脂通路誘導的PGC-1α-雌激素代謝軸構(gòu)成了新穎的肝臟增殖能量模型。該模型中，PGC-1α作為“點火器”點火并供能肝細胞激活；PGC-1α誘導

13、的雌激素作為“點火放大器”放大PGC-1α的能量供應(yīng)，并作為“啟動裝置”觸發(fā)肝細胞從激活到增殖的狀態(tài)躍遷；該過程通過PPARα脂肪酸氧化消耗血、肝TG供能，并通過LDLr介導的肝臟膽固醇吸收降低血TC。SAK-HV基于該肝增殖能量模型的獨特降脂新策略有潛力成為治療非酒精性脂肪肝、高膽固醇血癥以及高甘油三酯血癥的新型短周期生物療法。同時，該能量模型的提出也為肝增殖過程的脂代謝研究提供了新的啟示。
　　第二部分 SAK-HV促巨噬細胞

14、增殖機制研究
　　第一部分研究表明SAK-HV在體內(nèi)具有促肝細胞增殖效應(yīng)。巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞增殖是AS致病的關(guān)鍵因素。因此，我們在第一部分體外研究SAK-HV促肝細胞增殖機制的過程中，同時觀察了該抗AS蛋白對巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞是否具有促增殖效應(yīng)。結(jié)果顯示SAK-HV對小鼠胚胎肝細胞BNL-CL2和小鼠主動脈內(nèi)皮細胞MAEC增殖無顯著影響，卻意外地有效增強了小鼠巨噬細胞RAW264.7、人類單核細胞THP-1以及小鼠腹腔原代

15、巨噬細胞的增殖效應(yīng)。研究表明SAK-HV具有促巨噬細胞增殖特性。因此本研究在闡明SAK-HV降脂機制之后又進行了額外拓展，進一步通過RAW264.7細胞和小鼠腹腔原代巨噬細胞探索SAK-HV促巨噬細胞增殖機制。
　　我們首先篩查SAK-HV促增殖通路。結(jié)果表明SAK-HV處理RAW264.7細胞激活了增殖相關(guān)通路PI3K以及MAPK P38，JNK和ERK。通過抑制上述激活通路篩選出JNK和ERK MAPK是SAK-HV促巨噬細胞

16、增殖效應(yīng)的關(guān)鍵通路，并證實了它們在SAK-HV處理后原代巨噬細胞中的活化。
　　我們繼而研究SAK-HV促巨噬細胞增殖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過SAK-HV的三個功能域分別刺激RAW264.7細胞，結(jié)果表明SAK突變體是SAK-HV唯一有效地促進RAW264.7細胞增殖的功能域，且促增殖水平與SAK-HV相當；而野生型SAK則無此功能。結(jié)果證實SAK-HV通過SAK突變體功能域促發(fā)巨噬細胞增殖。
　　激光共聚焦顯微鏡以及對RAW264

17、.7細胞組分的Western blot檢測分析顯示SAK-HV可以進入RAW264.7胞漿，并少量入核。結(jié)合質(zhì)譜分析和免疫共沉淀實驗，我們篩選出Uba1是與SAK-HV具有直接相互作用的蛋白。同時激光共聚焦顯微鏡證實二者在RAW264.7胞內(nèi)和核內(nèi)存在共定位?；趯Ρ狙芯繑?shù)據(jù)的分析以及對大量已有研究的歸納，我們提出了一個SAK-HV介導的巨噬細胞增殖模型假說：SAK-HV通過阻斷Uba1與特定E2-E3酶對的交互作用抑制了它們對特定靶標

18、通路的泛素化修飾，促進巨噬細胞增殖效應(yīng)。通過在RAW264.7細胞和原代巨噬細胞中的Uba1抑制，我們證實了Uba1在SAK-HV觸發(fā)的巨噬細胞增殖效應(yīng)中的關(guān)鍵作用。該結(jié)果有力地支持了我們提出的模型假說。
　　在該模型的指引下，我們篩查發(fā)現(xiàn)伴隨總泛素化水平的升高，SAK-HV處理顯著抑制了MEKK1泛素化水平。有研究表明，MEKK1自泛素化可以抑制其激酶活性，從而降低JNK和ERK MAPK通路磷酸化水平。結(jié)果表明SAK-HV通過

19、抑制MEKK1泛素化水平激活下游JNK和ERK MAPK通路，促進巨噬細胞增殖效應(yīng)。
　　綜上所述，第二部分研究表明SAK-HV通過其SAK突變體功能域增強巨噬細胞增殖效應(yīng)，其機制是通過和MEKK1的自泛素化來激活JNK和ERK MAPK通路促巨噬細胞增殖；我們還提出基于Uba1的巨噬細胞增殖模型假說：SAK-HV與E1酶Uba1的相互作用，可能阻斷了Uba1與特定E2酶的交互，從而觸發(fā)上述途徑促進巨噬細胞增殖。盡管SAK-HV促