非生物脅迫下暖季型草坪草內參基因篩選及鐵離子調控耐鹽性的機制研究.pdf

1、內參基因是維持生物體生命活動的細胞器骨架的重要組成部分和參與生命代謝活動的基本單元，不受時空影響而在細胞內穩(wěn)定表達。選取適宜的內參基因對基于實時熒光定量PCR技術進行精確的基因表達分析具有重要意義。本研究第一部分以典型暖季型草坪草狗牙根（Cynodon dactylon）為材料，在鹽、干旱、高溫和低溫四種非生物脅迫下，應用實時熒光定量PCR技術，分析了ACT、 EF1α、 TUB、PP2A、TIP41、CACS、UPL7和GAPDH8個

2、候選內參基因在不同組織和不同非生物脅迫下的表達情況，并利用Genorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder四種程序，計算分析基因表達穩(wěn)定性。結果表明:在鹽、干旱、冷和高溫四種非生物脅迫下，8個內參基因在狗牙根葉片和根系中的表達穩(wěn)定性存在差異，其中，PP2A和CACS在鹽脅迫下根和葉片中、干旱脅迫下葉片中、冷或熱脅迫下根中表達穩(wěn)定性較高，EF1α和TIP41在干旱脅迫下根系中能較穩(wěn)定表達，UPL7、TUB和GA

3、PDH在冷脅迫下葉片中穩(wěn)定表達，PP2A和TIP41在熱脅迫下葉片中穩(wěn)定表達。
　　海濱雀稗(Paspalum vaginatum)是多年生暖季型鹽生草坪植物，實驗室前期通過酵母篩選從海濱雀稗耐鹽品種‘Sea Isle2000’全長cDNA表達文庫中捕獲得一個耐鹽候選基因——鐵離子轉運體，由此推測海濱雀稗優(yōu)異的耐鹽性歸因于在高鹽環(huán)境中具有超強的離子轉運能力，維持植物體內的離子平衡。而鐵是植物生長發(fā)育的必需元素之一，參與葉綠素合成、

4、光合呼吸代謝途徑，海濱雀稗的耐鹽性可能與鐵吸收相關?；诖?，開展了以下試驗:
　　1、以海濱雀稗(Paspalum vaginatum)耐鹽品種‘Sea Isle2000’為材料，通過基因克隆得到耐鹽候選基因——鐵離子轉運體PvIRT(cDNA全長1107bp、編碼369aa)，異源轉化鹽敏感的酵母細胞，顯著提高了其耐鹽性。通過qRT-PCR及錨定PCR等方法，進一步明確了PvIRT基因在鹽脅迫下的表達模式（鹽處理抑制根系PvIR

5、T表達）及克隆了PvIRT基因的上游1134bp的啟動子序列，結果顯示PvIRT基因受鹽脅迫顯著下調表達,PLACE數據庫分析PvIRT啟動子序列發(fā)現啟動子包含了許多脅迫相關的順式元件，如MYB-site，bHLH-site，ABA誘導，鹽脅迫誘導，JA或病原體誘導元件;此外，瞬時表達實驗表明PvIRT蛋白定位于擬南芥原生質體的細胞膜上。這為進一步研究該基因分子調控機制提供了線索。
　　2、以海濱雀稗(Paspalum vagin

6、atum)耐鹽品種‘Sea Isle2000’為試驗材料，采用水培法研究了鹽脅迫和正常生長條件下，比較了正常鐵濃度(20μ mol/L)和高濃度鐵(80μ mol/L)處理后對海濱雀稗生物量、葉片含水量、光合特性、根系活力和地上部和根系中Na+、K+和Fe2+等離子含量的影響。結果發(fā)現，正常生長條件下，高濃度鐵處理對海濱雀稗地上部和根系生物量，葉片的葉綠素含量、光合速率、光化學效率、相對含水量、蒸騰速率、氣孔導度無顯著差異，而明顯提高根

7、系離子含量(K+，Mg2+,Mn2+，Fe2+，Cu2+)和葉片離子含量(Mn2+，Cu2+)。鹽脅迫下，高濃度鐵(80μmol/L)處理表現出較高的根系活力和地上部生物量，同時顯著提高海濱雀稗的Fe2+、Mg2+和Cu2+等元素的含量，提高葉片的葉綠素含量、光化學效率和光合能力，促進植株生長發(fā)育;且植株根系通過增加對K+的吸收和Na+外排，維持細胞離子穩(wěn)態(tài)，減少鈉離子毒害，提高了海濱雀稗的耐鹽性。
　　3、以海濱雀稗(Paspa

8、lum vaginatum)耐鹽品種‘Sea Isle2000’的根系為試驗材料，采用水培法研究了正常生長下和鹽脅迫（10天）下，高濃度鐵(80μmol/L)處理對海濱雀稗根系Na+/H+轉運體(PvSOS1，PvCIPK24，PvCBL4)、Na+/K轉運體(PvCBL4)以及H+-質子泵(PvP-H+-ATPase, PvV-H+-ATPase)等基因表達的影響。結果發(fā)現，正常生長條件下，高濃度鐵處理顯著降低了PvCBL4和PvCB

9、L4基因表達，而位于液泡膜的V-H+-ATPase基因表達量大幅度增加;鹽脅迫下，高濃度鐵(80μmol/L)誘導了 PvSOS1，PvCIPK24，PvCBL4和PvCBL4、PvV-H+-ATPase等基因表達。因此，鹽脅迫下，高濃度鐵通過提高液泡膜上的PvV-H+-ATPase基因表達，為液泡膜Na+/H+逆向轉運體提供質子驅動力，將過量的鈉離子液泡區(qū)域化，同時上調質膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白表達，將Na+排到胞外，減少了鈉離