新型熒光探針的合成及其在SDS-PAGE上糖蛋白檢測技術(shù)的研究.pdf

1、目的:
　　1.基于席夫堿(PAS)的原理，合成了一系列具有熒光的酰肼類化合物。這些熒光化合物通過分子結(jié)構(gòu)上的肼基官能團(tuán)，可特異性地檢測混合蛋白中的糖蛋白。
　　2.在糖蛋白檢測領(lǐng)域現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的提高檢測靈敏度，縮短檢測時(shí)間，降低檢測成本。開發(fā)一種更加優(yōu)良、穩(wěn)定和實(shí)用的糖蛋白專屬檢測方法，更好地服務(wù)于糖蛋白組學(xué)領(lǐng)域的研究人員。
　　方法:
　　1.根據(jù)有機(jī)化學(xué)理論和文獻(xiàn)的指導(dǎo)，含醛基的化合物在常溫下極易與

2、含肼基的化合物發(fā)生反應(yīng)，生成相應(yīng)的腙、亞胺、酰胺脲等化合物。我們以含有苯環(huán)共軛的醛類為熒光母核，通過與含有兩個(gè)酰肼基的肼類化合物的一端酰肼基反應(yīng)得到目標(biāo)探針，再通過目標(biāo)探針的另一端酰肼基特異性地結(jié)合糖蛋白上氧化后的糖鏈，從而達(dá)到特異性地檢測糖蛋白的目的。在這一過程中，我們首先需要考察該探針的母核結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的有無特異性結(jié)合。如果沒有結(jié)合，說明該探針不會通過其它結(jié)構(gòu)去結(jié)合蛋白質(zhì)，從而極有可能通過一端的酰肼基特異性地去檢測糖蛋白，因此可作為

3、備選的熒光探針。
　　2.在備選染料的熒光探針中，選取產(chǎn)率高、熒光強(qiáng)、毒性低、成本較低的熒光探針進(jìn)行下一步考察。
　　3.我們分別通過對混合的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（同時(shí)含糖蛋白和非糖蛋白）以及分別從人血清、人成纖維細(xì)胞、小鼠心肌組織、小鼠肝臟組織提取的總蛋白樣品來共同考察這種新建立的糖蛋白檢測技術(shù)。
　　4.首先，樣品總蛋白經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離;分離后的凝膠置于一定比例的醇酸溶液中固定，用

4、于除去影響下一步氧化效率的殘留電泳液成分。
　　5.糖蛋白檢測大多數(shù)是根據(jù)經(jīng)典席夫堿的原理，首先加入氧化劑夠高效地將蛋白質(zhì)上糖基的鄰二羥基氧化成鄰二醛基，再與含氨基、肼基或腙基的熒光探針結(jié)合。我們選用了多種常用的氧化劑，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求從中篩選出具有水溶性好、毒性較低、氧化效率高，作用溫和的氧化劑進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，通過檢測結(jié)果確定最佳的氧化條件。
　　6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)殘留的氧化劑對檢測結(jié)果影響非常之大，為了去除殘留的氧化劑，

5、我們需要篩選一種有效的且不會影響后續(xù)檢測的還原劑。在選用的常用的還原劑中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求從中篩選出具有水溶性好、毒性較低、干擾少，進(jìn)一步通過檢測結(jié)果確定最佳的還原條件。
　　7.樣品處理完畢后，接著加入新合成的探針進(jìn)行染色。該過程仍需篩選探針的溶劑外環(huán)境、染色濃度、染色時(shí)間，最終確定其最佳著色條件。
　　8.經(jīng)熒光探針染色后的凝膠上的糖蛋白，需要置于凝膠成像儀內(nèi)成像，收集熒光信號。
　　9.最后，采用糖蛋白的去糖基化酶

6、(PNGase F)的去糖基化實(shí)驗(yàn)、凝集素富集實(shí)驗(yàn)、LC-MS/MS質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，同時(shí)與其他使用的糖蛋白檢測試劑盒進(jìn)行對比，共同來考察這種新方法術(shù)的選擇性、靈敏度和有效性。
　　結(jié)果:
　　1.從一系列合成的酰肼類熒光探針中，發(fā)現(xiàn)1-芘基碳酰肼(UGF202)，其在熒光、成本和檢測特異性方面均優(yōu)于其他備選染料。
　　2.從雙氧水、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、高碘酸(HIO4)等常用的氧化劑中，最終選擇了高碘酸作為氧化劑并篩選出了最

7、佳氧化條件。在室溫條件下，高碘酸以較低的濃度在20分鐘內(nèi)將糖蛋白上的糖鏈部分高效率地開環(huán)氧化成鄰二醛基，又可避免過度氧化。
　　3.從常用的還原劑中，如硼酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸(VC)，確定了抗壞血酸作為最佳還原劑，其優(yōu)點(diǎn)在于僅需5分鐘即可中和凝膠上殘留的高碘酸，而不會影響下一步熒光探針跟糖蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合，又能通過抗壞血酸的顏色變化來判斷高碘酸的去除情況。
　　4.總結(jié)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種新建立的糖蛋白特異性檢測方法

8、的操作步驟如下:
　　(1)經(jīng)SDS-PAGE分離后，凝膠置于50％甲醇(MeOH)5％無水醋酸(HAc)的固定液中固定20分鐘;
　　(2)棄去固定液，加入1％高碘酸(HIO4)的水溶液氧化20分鐘;
　　(3)棄去氧化液，加入1％抗壞血酸(VC)水溶液還原5分鐘;
　　(4)棄去還原液，加入由0.001％ UGF202，5％氮氮二甲基甲酰胺(DMF)和40％乙醇(EtOH)組成的染色液，作用20分鐘;

9、　　(5)置于凝膠成像儀上成像。
　　5.基于SDS-PAGE凝膠上糖蛋白的熒光檢測，分別從靈敏度、選擇性、檢測時(shí)間以及檢測成本的角度等去比較新建立UGF202的檢測技術(shù)與Pro-QEmerald糖蛋白檢測試劑盒:結(jié)果發(fā)現(xiàn)UGF202的檢測靈敏度是Pro-QEmerald試劑盒的2-4倍，在檢測特異性方面也略優(yōu)于Pro-Q Emerald試劑盒，并且大幅度地縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。
　　6.聯(lián)合二向凝膠電泳分離技術(shù)和