尿液miRNAs及蛋白質(zhì)標(biāo)志物在IgA腎病病情評(píng)估中的作用.pdf

1、背景和目的:IgA腎病(IgA nephrophathy,IgAN)是世界范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球疾病,病情輕重不一且預(yù)后有較大差異,作為一種終生性疾病需要對(duì)病情進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估,腎活檢是診斷IgAN的金標(biāo)準(zhǔn),但作為有創(chuàng)檢查,不易反復(fù)進(jìn)行。因而,尋找能反映IgAN病變程度和預(yù)后的無創(chuàng)生物標(biāo)志物具有重要意義。本課題通過檢測與IgAN炎癥、增殖、硬化相關(guān)的幾種尿液中miRNAs和蛋白質(zhì)標(biāo)志物,明確其表達(dá)變化及對(duì)IgAN病情評(píng)估的應(yīng)用價(jià)值。

2、r>　　方法:收集解放軍總醫(yī)院腎臟病科2012年9月至2013年3月首次經(jīng)腎活檢證實(shí)的IgAN患者。另設(shè)年齡性別匹配的健康人為對(duì)照組。在腎活檢前留取尿液標(biāo)本,分離尿沉渣和尿上清。腎臟病理采用Lee氏分級(jí)和半定量評(píng)分。
　　1、尿miRNAs的檢測:提取尿沉渣RNA,RT-PCR(realtime polymerase chain reaction,實(shí)時(shí)定量PCR)檢測miR-34a、miR-205、miR-21、miR-146a、

3、miR-155的表達(dá),分析尿miRNAs與IgAN臨床指標(biāo)及病理損害的關(guān)系。
　　2、尿蛋白質(zhì)標(biāo)志物的檢測:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測尿液上清sIgA、PDGF-DD、TGF-β1、MCP-1、TNF-α、IL-1β的表達(dá),分析其與IgAN臨床指標(biāo)及病理損害的關(guān)系。
　　3、繪制ROC曲線(receiver operating characteristic curve,受試者作業(yè)特征曲線)評(píng)估尿液各標(biāo)志物診斷IgAN的

4、敏感度和特異度。logstic回歸模型分析IgAN的危險(xiǎn)因素。分析聯(lián)合應(yīng)用尿miRNAs和蛋白質(zhì)標(biāo)志物評(píng)估IgAN病情的作用。
　　4、采用腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)阻斷劑和/或激素(或免疫抑制劑)對(duì)IgAN患者進(jìn)行治療并隨訪,探討這些尿液標(biāo)志物是否能反映疾病進(jìn)展和療效。
　　結(jié)果:納入IgAN患者52例,男31例,女21例,平均年齡33.45±10.36歲。其中Lee氏分級(jí)II級(jí)15例,III級(jí)24例,IV-V級(jí)13例

5、。25例健康對(duì)照組,男13例,女12例,平均年齡33.72±7.79歲。
　　1、IgAN尿沉渣miRNAs的檢測與臨床病理相關(guān)分析:與正常對(duì)照組相比,IgAN患者miR-34a、miR-205、miR-155降低、miR-21升高,miR-146a無顯著差異。miR-205與血清肌酐(Scr)、24h尿蛋白定量(U-Prot)負(fù)相關(guān),與腎小球?yàn)V過率(eGFR)正相關(guān)。miR-21與Scr、U-Prot正相關(guān),與eGFR負(fù)相關(guān)。隨

6、IgANLee氏分級(jí)增加尿沉渣miR-205水平逐漸降低,而miRNA-21水平逐漸升高。五種miRNAs在不同系膜增殖程度的患者間表達(dá)無差異。miR-205與腎小球全球硬化比例負(fù)相關(guān),miR-21與全球硬化和新月體比例呈正相關(guān)。IgAN腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化越重,尿miR-205水平越低,而miR-21越高,但miR-34a、miR-146a、miR-155無顯著差異。尿miR-21水平隨間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤程度加重而增加,miR-34a、

7、miR-205、miR-146a、miR-155無顯著差異。伴或不伴有腎血管病變的IgAN患者,尿中五種miRNAs的表達(dá)無差異。
　　2、IgAN尿蛋白質(zhì)標(biāo)志物的檢測與臨床病理相關(guān)分析:與正常對(duì)照組相比,IgAN尿sIgA、PDGF-DD、TGF-β1和MCP-1顯著升高,且與Scr、U-prot正相關(guān),與eGFR負(fù)相關(guān)。兩組間IL-1β和TNF-α無顯著差異。IgANLee氏分級(jí)IV-V級(jí)患者尿sIgA、PDGF-DD明顯高于

8、II級(jí)。IV-V級(jí)和III級(jí)患者尿TGF-β1、MCP-1明顯高于II級(jí)。隨系膜增殖程度增加,尿sIgA、PDGF-DD、TGF-β1、MCP-1、TNF-α水平增加。尿sIgA、TGF-β1和MCP-1水平均與腎小球硬化、總新月體比例、腎小管萎縮程度有關(guān),而腎間質(zhì)纖維化和炎細(xì)胞浸潤程度與尿sIgA、MCP-1和TNF-α水平有關(guān)。伴或不伴有腎血管病變的IgAN患者,尿中以上幾種蛋白質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)無差異。
　　3、聯(lián)合尿miRNA

9、s和蛋白質(zhì)標(biāo)志物對(duì)IgAN的評(píng)估作用。logistic回歸分析示PDGF-DD≥16.95pg/mgCr、MCP-1≥237.00pg/mgCr為IgAN的危險(xiǎn)因素。尿miR-205、miR-21、sIgA、PDGF-DD、TGF-β1、MCP-1均與Scr、U-prot、eGFR有一定相關(guān)性。sIgA、PDGF-DD、TGF-β1、MCP-1可以反映系膜細(xì)胞增殖輕重;miR-205、miR-21、sIgA、TGF-β1與腎小球全球硬化

10、、腎小管萎縮程度相關(guān);miR-21、sIgA、MCP-1可以反映間質(zhì)纖維化和炎細(xì)胞浸潤程度。MCP-1≥969.48pg/mgCr是中重度系膜增殖的危險(xiǎn)因素。miR-21(2-ΔΔct)≥0.8910,TGF-β1≥53.48pg/mgCr是腎小管中重度萎縮的危險(xiǎn)因素。miR-21(2-ΔΔct)≥0.8910提示間質(zhì)中重度纖維化。miR-21(2-ΔΔct)≥0.6190提示間質(zhì)炎細(xì)胞中重度浸潤。
　　4、尿液標(biāo)志物與臨床治療反

11、應(yīng)的相關(guān)分析。采用RAS阻斷劑和/或激素(或免疫抑制劑)治療,隨訪4個(gè)月后,患者U-Prot較前減少,eGFR較前升高(p=0.026)。激素/免疫抑制劑治療組,GFR的下降率(ml/min/1.73m2/month)與基線尿miR-146a正相關(guān),與MCP-1負(fù)相關(guān);尿蛋白減少(g/24h/month)與miR-205負(fù)相關(guān),與sIgA正相關(guān)。單純RAS阻斷劑治療組,GFR的下降率與基線尿PDGF-DD負(fù)相關(guān),尿蛋白的減少與TGF-β