新城疫病毒P-V蛋白單克隆抗體的制備及抗原表位鑒定.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)強(qiáng)毒引起的一種急性、烈性、高度接觸性禽類傳染病，是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一，給我國造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。我國對(duì)ND采取包括撲殺、強(qiáng)制性免疫等嚴(yán)格的防控措施，使其暴發(fā)和流行得到了一定的控制。該病在我國仍呈常在的地方流行，ND的防控面臨著一系列難題，臨床上弱毒活疫苗的使用和天然弱毒株的傳播使得臨床上新城疫強(qiáng)弱毒株的混

2、合感染現(xiàn)象非常普遍，嚴(yán)重影響了疫情的快速診斷。國內(nèi)常規(guī)的通過ICPI試驗(yàn)和F蛋白基因測序確定NDV毒力，無法實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)、迅速及時(shí)的新城疫強(qiáng)毒診斷。加強(qiáng)對(duì)NDV的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷方法和預(yù)防措施的綜合性研究顯得十分必要和緊迫。
　　本實(shí)驗(yàn)前期篩選到了針對(duì)P蛋白的廣譜型單克隆抗體，經(jīng)驗(yàn)證具有較好的反應(yīng)性和靈敏性。本研究通過將V蛋白特異性區(qū)域VCTD結(jié)構(gòu)域加His標(biāo)簽定向克隆至pET-28a原核表達(dá)載體。獲得的重組質(zhì)粒pET-28a-

3、ZJ1/VCD轉(zhuǎn)化BL21(DE3)進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并通過SDS-PAGE和Western blot檢測。表達(dá)的His-VCD重組蛋白His-VCD重組蛋白作為抗原，與佐劑混合免疫六周齡雌性BALB/c小鼠。四次免疫后，通過雜交瘤融合技術(shù)將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。通過間接ELISA檢測方法篩選分泌抗His-VCD重組蛋白單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細(xì)胞。初步篩選到的ELISA效價(jià)最高的1株雜交瘤，用于制備小鼠腹水，

4、命名為3D7。對(duì)McAb3D7用Western blot、間接ELISA和間接免疫熒光(IFA)方法進(jìn)行毒株差異性分析。結(jié)果表明McAb3D7特異性識(shí)別基因Ⅶ型NDV毒株。利用3D7作為V蛋白檢測工具，本文通過WB和WA研究了V蛋白不同時(shí)相表達(dá)量變化和亞細(xì)胞定位情況，發(fā)現(xiàn)V蛋白在NDV感染過程中的核趨向性運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象。
　　為了鑒定基因型特異性單抗McAb3D7和廣譜性單抗McAb4針對(duì)的抗原表位，構(gòu)建了一系列帶His標(biāo)簽截短表達(dá)的質(zhì)

5、粒，通過逐步截短表達(dá)重組蛋白，運(yùn)用Western-blots(WB)的方法進(jìn)行表位鑒定。McAb3D7針對(duì)的抗原表位為152RGPAELWK159，McAb4針對(duì)的抗原表位為46ALSLAWEKHG55。經(jīng)過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，McAb3D7表位在NDV不同基因型之間高度變異，但是在相同基因型內(nèi)相對(duì)保守，這說明McAb3D7可以作為區(qū)分NDV基因型的生物學(xué)檢測工具。McAb4抗原表位在不同毒株之間非常保守，McAM能作為NDV的生物學(xué)檢測