浮游植物對海水酸度和鹽度下降及石油烴污染響應機制研究.pdf

1、浮游植物是海洋主要初級生產(chǎn)者，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量流動中起十分重要作用。由于溫室效應氣體CO2的加劇排放，全球變暖、海冰融化、海平面上升，導致海洋酸度和鹽度下降。同時，隨著海上石油開發(fā)及運輸?shù)娜找姘l(fā)展，海洋石油泄露事故在全球各地頻發(fā)，石油烴污染已成為全球主要的海洋污染物之一。
　　本文針對海水酸度和鹽度下降及石油烴污染脅迫下，海洋浮游植物的生理生態(tài)響應及其對微量元素生物地球化學循環(huán)的影響的科學問題，以浮游植物生物量、抗氧

2、化能力、脂質過氧化、光致產(chǎn)生活性氧等4種指標來探討浮游植物的生理生態(tài)響應;首次以碳量子點(CDs)為示蹤劑標記浮游植物細胞和熒光檢測劑檢測胞內(nèi)活性氧和銅的含量;探討海水酸度和鹽度下降及石油烴污染對其抗脅迫能力和微量元素攝取的影響機制，獲得如下主要創(chuàng)新性結果:
　　1.構建碳量子點熒光探針法分析浮游植物胞內(nèi)外活性氧及金屬配合物生物可利用性
　　目前活性氧定量分析常用的有電子自旋共振、色譜及熒光分析等。然而，電子自旋共振和色譜分

3、析技術雖精度高，但存在需要昂貴的實驗設備，實驗過程復雜，檢測工作量大，受限因素多等缺陷。熒光分析技術因其快速準確，靈敏度高，數(shù)據(jù)采集簡化度高，顯微成像分辨率高等優(yōu)點。此技術在生物及化學檢測中可被廣泛作為高靈敏的活性氧熒光探針。本實驗基于CDs熒光信號穩(wěn)定、尺寸小，較其他的熒光量子點具有水溶性好、生物毒性低、易于大規(guī)模合成及功能化修飾、制備成本低廉和反應條件溫和等優(yōu)勢，可快速簡單測定浮游植物胞內(nèi)外活性氧的含量。
　　應用水楊酸表面修

4、飾的CDs(SA-CDs)，通過膜孔導入浮游植物細胞質中，水楊酸與胞內(nèi)活性氧結合產(chǎn)生2，3-二羥基苯甲酸，其與FeCl3反應，誘發(fā)熒光猝滅，據(jù)熒光信號變化值間接測定胞內(nèi)活性氧含量。SA-CDs表面酚羥基可與Fe3+快速反應生成紫色絡合物[Fe(C7H6O3)6]3-，該絡合物可被胞外活性氧誘導分解，顏色逐漸恢復至黃色，用比色法于波長入525檢測胞外活性氧含量。胞內(nèi)和胞外檢測法均具線性范圍廣(6-9.6×105 ng·L-1和3-2400

5、 ng·L-1)、精密度高（相對標準偏差RSD6.38％和2.19％）、檢測限低(5.32 ng·L-1和1.21 ng·L-1)等優(yōu)勢。胞內(nèi)檢測法限比高效液相色譜法（同以水楊酸為捕獲劑）低105倍。胞外檢測法與PeroxiDetectTM Kit法檢測結果不存在顯著性差異且檢測限低28倍。
　　以CDs為熒光檢測劑，CDs對Cu2+具較高的選擇特異性，因Cu2+與CDs分子中的-COOH和-NH2作用形成不發(fā)熒光的配合物導致熒光

6、快速猝滅，據(jù)CDs熒光信號變化來測定胞內(nèi)Cu2+含量。此法與國家標準法（水質銅的測定—2，9-二甲基-1，10-菲啰啉分光光度法）檢測結果不存在顯著性差異。將已標記的威氏海鏈藻(Thalassiosira weissflogii, CCMA-102)和小球藻(Chlorella vulgaris，CCMA-410)培養(yǎng)基中分別加入4種不同形態(tài)的銅(卟啉銅(Cu-Por)、鄰苯二甲酸銅(Cu-H2Lp)、Cu-EDTA和Cu2+)，各分兩

7、組（暗處理和光照組）。結果發(fā)現(xiàn):暗處理組兩種浮游植物胞內(nèi)CDs熒光僅能被Cu2+猝滅，說明只有Cu2+能透過膜孔進入胞內(nèi)與CDs結合;銅有機配合物可被光降解為Cu2+進入胞內(nèi)，誘發(fā)CDs熒光猝滅，據(jù)熒光猝滅程度，可得配合物分解速率為Cu-Por＞Cu-H2Lp＞Cu-EDTA，與配合物的吸光能力(Por＞H2Lp＞ EDTA)和穩(wěn)定常數(shù)(KcCu-Por(5.92)＜Kc Cu-H2Lp(12-14)＜KcCu-EDTA(20.57))

8、分別呈正相關和負相關，證實金屬只能以自由離子形態(tài)、被動擴散方式進入浮游植物胞內(nèi)。
　　2.海水酸度和鹽度下降對威氏海鏈藻生理生態(tài)和微量金屬攝取量的影響
　　以無毒的威氏海鏈藻作為本研究的沿海硅藻模式種，以CDs為示蹤劑，通過細胞密度、蛋白質、葉綠素a(Chla)、丙二醛(MDA)、超氧化岐化酶(SOD)、碳酸酐酶(CA)和光致產(chǎn)生活性氧等7個指標探討鹽度(32.0、31.0、30.0、29.0)和酸度(8.10、8.00、7

9、.90、7.80)下降對硅藻生理生態(tài)指標（如生物量、營養(yǎng)價值、光合作用、脂質過氧化、抗氧化能力和固碳能力）、微量金屬攝取量和抗脅迫能力的影響。
　　酸度下降對Chl a、MDA、蛋白質和活性氧的影響，鹽度下降對細胞密度、銅和鎘攝取量的影響均存在顯著性差異(p＜0.05）。在單一或者耦合作用下，CA和SOD間呈正相關，但與其他指標均呈負相關關系;鹽度下降對銅、鎘和鋅間的影響均存在顯著的正相關關系，如銅和鋅間的相關系數(shù)r高達0.989

10、;胞內(nèi)外活性氧之間亦呈明顯正相關關系(r=0.953，p＜0.05)。海水酸度和鹽度下降耦合對細胞密度、蛋白質、Chl a、SOD、CA和鋅的影響呈拮抗效應，而對MDA、銅和鎘的影響呈協(xié)同效應。酸度和鹽度下降降低了藻細胞抗脅迫能力，低pH和低鹽度持續(xù)脅迫比脅迫終止后強，且增強隨酸度或鹽度下降呈先增強后減弱趨勢。
　　酸度和鹽度下降對威氏海鏈藻的影響是通過誘發(fā)藻體產(chǎn)生活性氧，從而降低生物量（抑制細胞生長、葉綠素a和蛋白質合成）和固碳

11、能力（碳酸酐酶活性降低），促進抗氧化能力(SOD酶活性增強)和脂質過氧化(MDA含量上升)。
　　3.石油烴污染對小球藻生理生態(tài)及微量元素攝取量的影響
　　研究了小球藻在含或不含石油烴(WSF)培養(yǎng)基中30代不斷繁殖后細胞中β胡蘿卜素、Chl a、 SOD、 MDA、光致產(chǎn)生活性氧和微量元素攝取量等影響，以CDs為示蹤劑，探討WSF對浮游植物生理生態(tài)指標、微量元素可給性和抗脅迫能力的影響。
　　小球藻對WSF污染具很強

12、的適應和耐受能力，且在持續(xù)脅迫環(huán)境下具更強的生存競爭力。胞內(nèi)/外活性氧、β胡蘿卜素、·OH、MDA、SOD、錳和硒兩兩間均呈正相關關系，但與Chl a呈負相關。WSF對對數(shù)期和穩(wěn)定期SOD活性、釩、錳和砷吸附量的影響均存在顯著性差異(p＜0.05，F(xiàn)＞Fα);當WSF持續(xù)脅迫對處于兩種生長周期的細胞中錳、硒吸收量和鎳、硒吸附量的影響，當脅迫終止時對丙二醛含量的影響均存在顯著性差異。
　　本研究表明小球藻對石油烴污染具很強的適應和耐