甲減大鼠心肌中miR-206和胰島素樣生長因子-1表達的關系.pdf

1、研究背景及目的:
　　 甲狀腺功能減退癥（甲減，Hypothyroidism）可使全身多臟器受累，其中心血管系統(tǒng)最為明顯，占大約70％-80％，包括心律失常、心包積液、心臟假性肥大、左室收縮和舒張功能下降、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓等。甲減時TH(ThyroidHormone，TH)分泌減少，可以在基因水平發(fā)揮作用影響心臟功能。微小RNA(microRNA，miRNA)，是一類21-25nt單鏈非編碼小分子RNA，具有高度

2、的保守性、時序性和組織特異性，通常與靶mRNA的3'非編碼區(qū)(3'Untranslatedregion，3'-UTR)互補結合，在轉錄后階段抑制其靶基因的表達TH。mir-206是一種心肌及骨骼肌特異性miRNA，在甲減時表達水平明顯升高。作為mir-206的靶基因——胰島素樣生長因子-1（Insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）可以舒張血管、保護缺血心肌，并可促進心肌細胞肥大、增強心肌收縮力等。mir-206

3、及IGF-1在甲減心肌病變中的發(fā)病機制未見相關報道。
　　 本研究通過觀察甲減動物模型的心肌損傷情況，應用實時定量聚合酶鏈反應(RealTimepolychainreaction，RealTime-PCR)檢測心肌組織mir-206及其靶基因IGF-1的表達，Westernblot檢測IGF-1蛋白表達水平，從而探討甲減致心肌病變的分子生物學機制。
　　 方法:
　　 1.大鼠分組及甲減模型的建立:30只SPF級

4、雄性Wistar大鼠，體重200～220克，隨機分成3組:正常對照組（C組，n=8）;甲減組（H組，n=22），行甲狀腺全部切除手術，4周(4w)后測定血清促甲狀腺激素(TSH)及總甲狀腺素(TT4)，TSH明顯升高及TT4下降大鼠為甲減大鼠動物造模成功;甲減L-T4治療組(HL組，n=8)，甲減組大鼠造模成功后16w，于甲減組中隨機選取8只，予皮下注射L-T4治療8w。
　　 大鼠按組分籠喂養(yǎng)，飼以普通大鼠飼料。所有大鼠于實驗

5、28w時，予10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，取心肌組織，一部分立即放入組織保存液中，并迅速轉移至-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪徊糠种糜?％多聚甲醛中固定24-48h，進行病理組織學樣品制備。
　　 2.血清甲狀腺功能指標測定:大鼠甲狀腺切除術后4w眶后靜脈叢取血、甲減造模成功后24w于心臟取血，分離血清，血清送至中國醫(yī)科大學內分泌研究所，應用免疫熒光方法測定血清TSH及TT4。TT4測定的靈敏度為1μg/dl。
　

6、　 3.心肌組織病理學檢查:心肌組織H-E染色后，觀察組織形態(tài)學變化。
　　 4.心肌組織α-MHC及β-MHC表達檢測:提取各組大鼠心肌組織RNA，RealTime-PCR方法檢測α-肌球蛋白重鏈(MoysinHeavyChain，MHC)、β-MHC，比較C、H、HL三組心肌病變情況。
　　 5.心肌組織mir-206及IGF-1表達檢測:提取各組大鼠心肌組織RNA，RealTime-PCR方法檢測mir-206的

7、表達及IGF-1的mRNA的表達。提取各組大鼠心肌組織蛋白，Westernblot方法測定IGF-1的蛋白表達。
　　 結果:
　　 1.甲功與體重變化:甲狀腺切除4w后，與C組比較，H組大鼠TSH（6.588±1.621vs0.053±0.014，P＜0.01）及HL組大鼠TSH（4.955±1.011vs0.053±0.014，P＜0.01）明顯升高，H組TT4（1.745±1.007vs4.495±0.454，P＜

8、0.01）及HL組TT4（1.710±0.750vs4.495±0.454，P＜0.01）明顯減低，證實甲減造模成功;28w時，與C組比較，H組TSH（7.763±4.320vs0.083±0.040，P＜0.01）明顯升高，H組TT4（1.417±0.295vs3.945±0.713，P＜0.01）減低，與H組比較，HL組TSH（0.420±0.150vs7.763±4.320，P＜0.01）明顯減低，HL組與C組比較TSH無差異（0

9、.420±0.150vs0.083±0.040，P＞0.05），HL組與H組比較TT4值（3.075±1.263vs1.417±0.295，P＜0.01）升高，HL組與C組比較TT4值無差異（3.075±1.263vs3.945±0.713，P＞0.05），證明皮下注射LT4治療有效。28w時，大鼠體重與C組比較，H組（333.800±61.000vs530.500±39.300，P＜0.01）和HL組（378.000±51.800vs

10、530.500±39.300，P＜0.01）均明顯減低，HL組略高于H組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 2.心肌病理改變:C組大鼠心肌纖維排列規(guī)整，細胞核染色質均勻分布，核呈橢圓型，位居中央，心肌細胞之間間隙緊密;H組大鼠心肌中，心肌細胞排列紊亂，心肌細胞之間間隙增寬，心肌細胞萎縮;HL組大鼠心肌細胞也有萎縮，但與H組大鼠相比病變減輕。
　　 3.心肌組織α-MHC及β-MHCmRNA表達:與C組大鼠相比，

11、H組大鼠心肌中α-MHC表達量（0.325±0.027vs1.008±0.137，P＜0.01）明顯減少，HL組α-MHC表達量（1.078±0.274vs1.008±0.137，P＞0.05）略升高，與H組相比，HL組α-MHC表達量（1.078±0.274vs0.325±0.027，P＜0.01）明顯升高;與C組大鼠相比，H組β-MHC表達量（2.661±0.896vs1.027±0.265，P＜0.05）明顯升高，HL組β-MHC

12、表達量（0.721±0.082vs1.027±0.265，P＞0.05）略減低，H組比較，HL組β-MHC表達量（0.721±0.082vs2.661±0.896，P＜0.01）明顯下降。
　　 4.心肌組織mir-206表達量:28w時，與C組（1.044±0.352）大鼠相比，H組大鼠（3.695±1.516）的mir-206表達量升高至對照組的2.539倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HL組（1.488±0.946）

13、與C相比無明顯差異(P＞0.05)，但與H組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 5.心肌組織IGF-1的mRNA表達:C組(1.015±0.185)、H組（1.298±0.412）、HL組（1.029±0.397）間比較，心肌組織中IGF-1的mRNA表達水平均無顯著差異（P＞0.05）。
　　 6.IGF-1蛋白表達:28w時，與C組大鼠相比，H組大鼠（0.101±0.004vs0.149±0.00

14、3，P＜0.01）IGF-1蛋白表達量明顯下降，HL組IGF-1蛋白表達量(0.160±0.001vs0.149±0.003，P＞0.05)無明顯差異;與H組相比，HL組IGF-1表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 1.甲減大鼠α-MHC表達減少，β-MHC表達升高;病理結果顯示甲減組大鼠心肌中心肌細胞萎縮，出現(xiàn)明顯心肌改變。
　　 2.甲減大鼠心肌中mir-206的表達升高，