載納米銀海藻酸鈣制備、抗菌性能、促創(chuàng)面愈合及生物相容性的研究.pdf

1、開放傷口由于皮膚完整性遭到破壞，失去了正常防御細菌的屏障能力，創(chuàng)面的壞死組織和含有大量蛋白質(zhì)的滲出液又是細菌繁殖的良好培養(yǎng)基，在多種因素的作用下，創(chuàng)面容易發(fā)生局部感染、甚至引起全身感染，最終引起愈合時間的延長。近些年以來，研究逐漸發(fā)現(xiàn)，傷口在濕潤的環(huán)境下比干燥的環(huán)境下要愈合得快[1]，如果創(chuàng)面皮膚局部浸漬，會削弱宿主抵御細菌侵襲的防御屏障，但另一方面，在干燥條件下，細胞的活動反而受到抑制，會形成痂，并進一步發(fā)生組織壞死的可能，影響傷口愈

2、合[2，3]。由此思路出發(fā)，研制一種具有高吸收性、又能保持創(chuàng)面濕潤的敷料，對于治療外科感染傷口和慢性潰瘍性創(chuàng)面，具有重要意義。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展及生物材料的廣泛應用，目前認為一款理想的敷料需具備以下幾種生物學性能:①可大量吸收創(chuàng)面的滲出物，同時又能保證創(chuàng)面具有一定濕度;②具有良好的生物相容性;③易去除性，即移去敷料時不會造成傷口二次損傷;④具有一定的抗菌性;⑤生物可降解性能，不會造成環(huán)境污染。
　　由海藻酸鹽加工得到的海藻酸纖維含

3、有多種氨基酸，具有良好的生物相容性，在鈣離子的存在條件下可交聯(lián)形成網(wǎng)狀開放晶格的水凝膠，具有很好親水性的水凝膠，可使得包埋在其中的細胞進行以滲透擴散為主的營養(yǎng)和代謝物質(zhì)交換[4]，同時為傷口提供濕潤的愈合環(huán)境。以海藻酸鹽為原料研發(fā)的海藻酸鈣纖維具有無毒性、高吸水成凝膠性、良好的生物相容性、易去除性、良好的生物降解性、止血性能、能促進傷口愈合等優(yōu)越特性[5]，因而被廣泛用于材料植入、人工牙體、生物填充等。此外，海藻酸鹽纖維來源廣泛，加工工

4、藝簡單，加工過程無毒性物質(zhì)加入，制造成本低廉，是一種性價比較高的生物材料。
　　銀作為抗菌劑使用由來已久，銀離子、可溶性銀化合物、表面積大的膠態(tài)銀、納米銀等均具有殺滅細菌、真菌的特性[6，7]。其中納米銀是以納米技術(shù)為基礎(chǔ)研制而成的新型抗菌產(chǎn)品，其依靠著量子效應[8]、小尺寸效應[9]和具有極大的比表面積[10]，因而具有傳統(tǒng)無機抗菌劑無法比擬的抗菌效果[11]。此外，納米銀粒子具有很強的滲透性，能滲透到皮下組織，與切口接觸后迅速

5、持久地釋放納米銀，快速有效地殺滅切口及縫線上的病原體[12]。如今，以納米銀為基礎(chǔ)的抗菌產(chǎn)品在臨床上得到了廣泛的應用。
　　本課題在海藻酸鹽溶液中加入一定量羧甲基纖維素，并利用濕法紡絲得到改性后的海藻酸鈣羧甲基纖維復合物，最后利用浸漬富集法制備載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料，該敷料的研制對防治外科傷口感染、促進慢性傷口愈合等有重大的意義。
　　目的:
　　研制載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料，并對其物理學表征進行檢測，充分評價其細胞

6、毒性、抗菌性能及生物相容性，從中篩選出最適載銀量的抗菌敷料，為其作為優(yōu)質(zhì)敷料進一步應用于防治外科感染傷口、促進傷口愈合提供最佳的選擇。
　　方法:
　　1、載納米銀海藻酸鈣敷料的制備
　　本課題采取的是濕法紡絲+浸漬富集法制備載納米銀海藻酸鈣敷料，方法如下:濕法紡絲:將海藻酸鈉、羧甲基纖維素納按8.5∶1.5比例放入水溶液中，高速攪拌，形成粘稠溶液，脫泡過濾后通過噴絲孔擠出到含有鈣離子的凝固浴中，形成固態(tài)海藻酸鈣羧甲基

7、纖維長絲。該長絲經(jīng)過拉伸、水洗、脫水干燥、卷曲形成纖維，纖維可梳理成網(wǎng)而制成非織造布。
　　浸漬富集法:2000mg/L的納米銀溶液用去離子水稀釋成不同濃度的納米銀溶液，加入等量海藻酸鈣羧甲基纖維素敷料后37℃恒溫震蕩30分鐘，后經(jīng)脫水、乙醇洗滌，溫度梯度烘干，-20℃過夜，制成質(zhì)量分數(shù)為0.5％、1％、2％、4％的載納米銀海藻酸鈣羧甲基纖維素復合物，簡稱:載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料，AgNPs-Ca。
　　2、載納米銀海藻酸

8、鈣敷料的物理學表征檢測
　　2.1 紫外-可見光分光光度計檢測敷料吸收光譜特征
　　將樣品浸泡于去離子水中，搖蕩30min，過濾器濾去海藻酸鈣纖維，并將最終溶液置于NanoDrop2000紫外-可見光分光光度計，設置0.5nm掃描間隔，最后獲取粒子分布曲線。
　　2.2 光學顯微鏡下的敷料樣品
　　取小量樣品盡量撕拉成分散纖維，置于載玻片上，滴加樹脂后封片干燥，制成可長期保存的敷料玻片。將玻片置于OLYMPUS光

9、學顯微鏡上觀察，拍照。
　　2.3 敷料樣品的電子顯微結(jié)構(gòu)分析
　　將載納米銀海藻酸鈣敷料裁剪成8×8mm，厚5mm，并置于60℃烘干機、2小時徹底干燥，戊二酸及鋨酸雙固定標本，以離子濺射鍍膜法將鉑蒸發(fā)后覆蓋在樣品上，將處理好的樣品置于掃描電子顯微下，觀察載納米銀海藻酸鈣敷料中纖維及納米銀的形態(tài)、分布情況。
　　3、載納米銀海藻酸鈣敷料的細胞毒性檢測
　　將普通敷料、海藻酸鈣敷料、0.5％-AgNPs-Ca、1％

10、-Ag Ps-Ca、2％-AgNPs-Ca、4％-AgNPs-Ca、Ag+-Ca等7個組的樣品浸提液各2ml，分別置于35mm細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入2×104/ml LO2細胞懸液2ml，置于培養(yǎng)箱24h，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況。
　　將100ul濃度為6×104/mL的細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，細胞貼壁后棄原液，將普通敷料、海藻酸鈣敷料、0.5％-AgNPs-Ca、1％-AgNPs-Ca、2％-AgNPs-Ca、4％

11、-AgNPs-Ca、Ag+-Ca等7個組的樣品浸提液各100μl，置于細胞培養(yǎng)箱孵育24小時。采用CCK-8法測定LO2細胞培養(yǎng)的相對增殖率(RGR)，評價材料的細胞毒性。
　　4、載納米銀海藻酸鈣敷料的抗菌性能檢測
　　4.1 抑菌圈實驗
　　挑選金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌菌落，制成1×106cfu/ml的菌懸液，用棉拭子粘取菌懸液在培養(yǎng)板沿著三個方向均勻涂劃，最后將棉拭子在培養(yǎng)板邊緣涂抹一圈

12、，蓋好干燥5min。將培養(yǎng)板均分為5部分，沿著順時針方向依次放入海藻酸鈣敷料、0.5％-AgNPs-Ca、1％-AgNPs-Ca、2％-AgNPs-Ca、4％-AgNPs-Ca的10mm圓片，最后放入37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20h，拍照后，使用Image J軟件測繪，得到抑菌圈直徑。
　　4.2 振蕩抑菌實驗
　　在離心管中加入5ml細菌濃度3×104cfu/ml的菌液，并將普通敷料、海藻酸鈣敷料、0.5％-AgNPs

13、-Ca、1％-AgNPs-Ca、2％-AgNPs-Ca、4％-AgNPs-Ca、Ag+-Ca等7組實驗敷料分別裁剪成10×10mm的正方形樣片，經(jīng)紫外線消毒2h后，各取2塊放入離心管中。25℃，轉(zhuǎn)數(shù)為200r/min，分別于振蕩前、振蕩1h后、2h取100ul涂板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h后計數(shù)，計算1h、2h抑茵率，并篩選出合適濃度進行下一步實驗。
　　結(jié)果:
　　1、載納米銀海藻酸鈣敷料的物理學表征檢測
　　紫外-可見光分

14、光光度計分析載納米銀海藻酸鈣敷料的吸收峰位于416nm處，此外其分布范圍在350～550nm之間。而未添加納米銀的海藻酸鈣敷料的紫外光譜則沒有特殊的吸收峰。
　　掃描電子顯微鏡下的載納米銀海藻酸鈣敷料，海藻酸鈣纖維大小均一，直徑在10～15μ m之間，敷料中納米銀呈規(guī)則的球形，粒徑在80～100nm之間，附著于海藻酸鈣纖維表面及空隙之間。
　　2、載納米銀海藻酸鈣敷料的細胞毒性檢測
　　不同實驗組之間細胞增值率差異具有

15、統(tǒng)計學意義(F=305.04，P＜0.001)，經(jīng)24h培養(yǎng)，海藻酸鈣敷料組細胞相對增值率(RGR)為99.66％，細胞毒性反應0級;0.5％-AgNPs-Ca組與1％-AgNPs-Ca組LO2細胞的RGR分別為94.0％和92.8％，細胞毒性反應Ⅰ級，無細胞毒性，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。2％-AgNPs-Ca組LO2細胞RGR為69.4％，細胞毒性反應Ⅱ級，輕度細胞毒性。4％-AgNPs-Ca組與Ag+-Ca組LO2細胞RGR分別為

16、27.2％、23％，細胞毒性反應Ⅲ、Ⅳ級，均為中度細胞毒性。
　　結(jié)論:
　　1、本課題用濕法紡絲制得海藻酸鈣羧甲基纖維素復合物纖維，再經(jīng)浸漬富集法制備了載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料，通過實驗證實并篩選的1％載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料具備優(yōu)良的抗菌性能、促創(chuàng)面愈合能力和優(yōu)異的生物相容性。
　　2、通過紫外-可見光分光光度法及掃描電子顯微鏡觀察證實，載納米銀海藻酸鈣敷料可在水中溶解出納米銀顆粒，并具有較低的分散性，另外，海藻酸

17、鈣纖維直徑均一，納米銀顆粒于纖維表面分布均勻。
　　3、細胞毒性檢測證實載納米銀海藻酸鈣敷料的細胞毒性呈濃度依賴性，其中0.5％、1％-AgNPs-Ca屬于無細胞毒性。
　　4、根據(jù)QB/T2591-2003規(guī)定材料對微生物的抑菌率＞90％才能被稱為抗菌材料，通過抑菌圈及振蕩抑菌法證實載納米銀海藻酸鈣敷料具有優(yōu)良的抗菌性能，其中1％-AgNPs-Ca被證實具有長效抑菌的能力。
　　5、動物實驗證實載納米銀海藻酸鈣敷料可