基于酶擴增合成銅納米顆粒及其在生物傳感上的應用.pdf

1、納米技術的提出為納米材料科學的發(fā)展及應用開辟了新的領域?，F代科學研究中，納米技術結合物理、化學、生物和醫(yī)學成像和超靈敏檢測的方法在分析化學和生命科學中的地位越來越重要，是一個極具前景的領域。由于粒徑微小（1-100 nm）,金屬納米材料在化學、物理和電子性質非常獨特，可用作構建新型的傳感設備，特別在生化傳感和電化學傳感等方面。金屬納米材料的運用可以降低檢測限，提高傳感器的靈敏性，開拓一些已有材料不能完成的新的工作。
　　近年來，以

2、DNA為模板來合成銅納米顆粒（DNA-CuNPs）在生物成像及傳感應用中引起了越來越多研究者的廣泛關注。因為其具有細微的尺寸，低毒性和很好的生物相容性的優(yōu)勢，相比于現已存在的熒光金屬納米粒子，以 DNA為模板合成的銅納米顆粒是一種新型的功能化生物化學探針。末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT），是一種特別的DNA聚合酶，它通過在DNA引物的3′-OH端不斷添加堿基，催化無模板的DNA發(fā)生聚合反應。TdT廣泛用作分子生物工具，用來標記DNA末端。

3、本文基于TdT的擴增反應，提出了一種合成DNA-CuNPs的新型方法，并應用于酶的活性檢測和分析。具體如下：
　　1、利用TdT催化單鏈 DNA（ssDNA）聚合反應的性質，開發(fā)出了一種新型的DNA-CuNPs合成方法。在一條原本不能合成CuNPs的DNA3′-OH端通過TdT催化發(fā)生聚合反應，從而在該DNA引物3′-OH端不斷添加堿基，得到一段聚合胸腺嘧啶（polyT）的DNA序列，然后以這段 polyT為模板合成能夠發(fā)射熒光的

4、DNA-CuNPs。此外，我們優(yōu)化了TdT擴增反應的條件，以及可能會影響合成DNA-CuNPs的因素。并且比較分別以 DNA-P-polyT和T40為 DNA模板合成DNA-CuNPs，發(fā)現以DNA-P-polyT為模板合成的DNA-CuNPs發(fā)射出更高的熒光強度。同時，我們通過透射電子顯微鏡（TEM）來表征DNA-CuNPs。根據TEM圖，我們分析以長鏈為模板合成的DNA-CuNPs熒光強度更大的原因是：1)長鏈DNA序列可以移除Cu

5、NPs表面極性溶劑，從而更好的保護CuNPs；2)熒光共振能量轉移（FRET）的現象可能存在于CuNPs之間。
　　2、基于新型 DNA-CuNPs合成方法的構建，我們提出了一種 TdT的活性分析檢測方法。該方法實現了對TdT進行無標記、低背景、高靈敏地“turn-on”酶活分析，檢測限為3.75 U/mL。此外，該方法具有較穩(wěn)定的重復性，在復雜生物環(huán)境中的添加回收取得了較滿意的結果。接著，我們考察了TdT抑制劑焦磷酸鈉對TdT的

6、抑制效果。
　　3、基于TdT對隨機DNA底物擴增及新型DNA-CuNPs的合成，我們構建了一個酶活檢測的通用性平臺。我們選取限制性內切酶（BamHI）和堿性磷酸酶(ALP)作為目標分析物。實驗得到，BamHI的檢測限為0.005 U/mL，信背比為31.4，跟相關文獻報道的相仿；ALP的檢測限為0.052×10-3U/mL，信背比為44.6，比相關文獻報道較低。由于酶對底物具有特異性，所以BamHI和ALP的選擇性都很好。此外，

7、只需要換成不同的酶對應的DNA底物，就可以應用于核酸外切酶、切刻內切酶、DNA連接酶的活性分析。
　　4、基于核酸內切酶V(EndonucleaseV)可以識別并切割脫氨基損傷以及切刻內切酶Nt.BbvCI特異性識別并切割含有其識別序列的DNA，我們把前面提出的新型DNA-CuNPs合成方法用于Endonuclease V的“turn-on”放大檢測。通過合理地設計三條 DNA探針─一條含脫氧次黃嘌呤核苷的探針(Sub-DNA），