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文檔簡介
1、草甘膦是1973年上市使用的一種廣譜除草劑。許多文獻報道草甘膦能對機體各組織產(chǎn)生一定的毒性,引發(fā)心臟功能不全者發(fā)生心律不齊等現(xiàn)象,引起中老年人產(chǎn)生諸如阿爾茨海默病、帕金森病等腦部退行性疾病。草甘膦通常采取噴灑施用,因此它可以通過呼吸系統(tǒng)由鼻腔進入到人體血液循環(huán)系統(tǒng)后到達體內(nèi)各組織。由于人體鼻腔存在鼻腦通路,草甘膦亦有可能經(jīng)此這條通路直接從鼻腔進入腦部,直接引發(fā)其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用。許多內(nèi)源性或外源性化學物質(zhì)在人體內(nèi)的藥動學過程均與
2、體內(nèi)廣泛存在的轉(zhuǎn)運體相關(guān),據(jù)文獻報道,鼻黏膜組織上存在大量轉(zhuǎn)運體。其中,有機陽離子轉(zhuǎn)運體(OCT)、P-糖蛋白外排轉(zhuǎn)運體(P-gp)以及氨基酸轉(zhuǎn)運體等在小鼠、大鼠、牛、人鼻黏膜內(nèi)均有表達??紤]到草甘膦的化學結(jié)構(gòu)具有很強的極性,與氨基酸結(jié)構(gòu)很相似,提示草甘膦可能通過鼻黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運體介導的跨膜轉(zhuǎn)運經(jīng)鼻腦通路直接進入腦內(nèi),使其所引起的毒性遠大于經(jīng)呼吸、吞咽等方式進入體循環(huán)過程所引起的毒性。本文主要研究氨基酸轉(zhuǎn)運體在草甘膦跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運中的作用
3、,并分析草甘膦通過鼻腦通路途徑進入到腦部而產(chǎn)生毒副作用的可能性。
為了檢測不同生物樣品中的草甘膦濃度,本文參考相關(guān)文獻報道建立了草甘膦的氣相色譜-氫焰離子(GC-FID)和液相色譜-熒光(HPLC-FD)的檢測方法,并進行了方法學驗證。GC-FID采用三氟乙酸酐(TFAA)和三氟乙醇(TFE)對草甘膦進行柱前衍生,使用Agilent? HP-1氣相色譜柱進行檢測,并采用內(nèi)標法,樣品出峰時間為5.72 min,內(nèi)標出峰時間為11
4、.56 min,分析時長為24 min;HPLC-FD采用芴酰氯(FMOC-Cl)對草甘膦進行柱前衍生,使用Thermo? C18色譜柱進行檢測,采用外標法,樣品出峰時間為7.30 min,分析時長為20 min;二者的分析時長均保證了高通量樣品分析。方法學驗證結(jié)果表明,GC-FID檢測條件下,在10-800μg?mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,r>0.99;HPLC-FID檢測條件下,在5-800 ng?mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)
5、良好的線性關(guān)系,r>0.99,符合生物樣品測定要求。兩種分析方法條件下,草甘膦均具有良好的峰型,高、中、低三個濃度下日內(nèi)、日間精密度均小于13.66%,不同條件下的穩(wěn)定性偏差在±15%以內(nèi),準確性亦符合生物樣品測定的要求,表明此兩種檢測方法準確靈敏,能夠?qū)Ω鞣N生物基質(zhì)中的草甘膦進行準確定量。
為了考察草甘膦跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運的特性,本文選取了與人鼻黏膜結(jié)構(gòu)極其相似的牛鼻黏膜在擴散池模型上對草甘膦跨牛鼻黏膜的轉(zhuǎn)運進行研究。分別采用牛呼
6、吸黏膜與嗅黏膜進行草甘膦跨膜轉(zhuǎn)運實驗,并考察2,4-DNP(ATP阻斷劑)對草甘膦的轉(zhuǎn)運過程的影響,根據(jù)測定實驗前后跨膜電阻值(TEER)的變化以及冷凍切片實驗結(jié)果,分析實驗過程對牛鼻黏膜完整性的影響。結(jié)果表明草甘膦在牛鼻黏膜上的轉(zhuǎn)運屬于非能量依賴型,可能是由主動轉(zhuǎn)運和被動擴散共同參與的過程(呼吸黏膜中Km值為1.002±0.374μg·mL-1,Vmax值為0.1283±0.016μg·cm-2·min-1;嗅黏膜中Km值為0.371
7、±0.050μg·mL-1,Vmax值為0.0163±0.005μg·cm-2·min-1)。牛鼻黏膜在實驗過程中跨膜電阻值沒有發(fā)生明顯變化(實驗前后TEER值均大于100Ω?cm2),切片觀察未發(fā)現(xiàn)損傷。根據(jù)氨基酸轉(zhuǎn)運體家族中各亞型的底物選擇性以及Na+依賴性的不同,考察不同種類氨基酸轉(zhuǎn)運體特異性底物以及抑制劑對草甘膦跨膜轉(zhuǎn)運的影響。實驗結(jié)果表明草甘膦跨鼻黏膜的轉(zhuǎn)運屬于Na+非依賴型;經(jīng)典的氨基酸轉(zhuǎn)運體底物(L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、
8、L-丙氨酸)與抑制劑(BCH等)均能顯著抑制草甘膦的跨膜轉(zhuǎn)運??紤]到實驗過程中,轉(zhuǎn)運體表達量的變化也可能影響草甘膦的轉(zhuǎn)運過程,采用Western Blot方法測定牛鼻黏膜上的蛋白表達水平,結(jié)果顯示牛鼻黏膜上表達的L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運體的表達量未受到底物草甘膦或抑制劑的影響,表明草甘膦跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運速率下降是與氨基酸轉(zhuǎn)運體底物發(fā)生了競爭性抑制。
為了進一步探索草甘膦轉(zhuǎn)運過程涉及的轉(zhuǎn)運體,選用廣泛表達各類轉(zhuǎn)運體的Caco-2細胞模型進行
9、草甘膦跨膜攝取研究。Caco-2細胞通常被用于人體小腸吸收模型的研究,其表面表達多種氨基酸轉(zhuǎn)運體,是研究氨基酸轉(zhuǎn)運體的常見模型之一。本文考察了草甘膦轉(zhuǎn)運的時間依賴型和濃度依賴型特征。結(jié)果表明草甘膦在隨濃度或時間變化的過程中,其攝取速率首先呈線性變化,但在達到某一濃度/時間后,開始趨于飽和狀態(tài),與前述跨牛鼻黏膜轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果一致,提示草甘膦的Caco-2細胞攝取存在主動轉(zhuǎn)運過程(Km=461±168μM,Vmax=166±26 ng·mL-
10、1·mg-1 protein)。為了進一步考察草甘膦攝取過程中可能涉及的轉(zhuǎn)運體,分別采用含有Na+不含有Na+的緩沖液對其進行研究,結(jié)果表明Caco-2細胞對草甘膦的攝取并不受Na+影響。選取了不同類型氨基酸轉(zhuǎn)運體的底物或抑制劑,對草甘膦的攝取過程進行進一步的研究,結(jié)果表明不同類型的氨基酸轉(zhuǎn)運體底物,尤其是L系統(tǒng)底物抑制了草甘膦的攝取速率,說明L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運體底物可能對草甘膦的跨膜轉(zhuǎn)運存在競爭性抑制作用。
氨基酸轉(zhuǎn)運體在Ca
11、co-2細胞兩側(cè)均有表達,為了明確兩側(cè)氨基酸轉(zhuǎn)運體在草甘膦轉(zhuǎn)運過程中的作用,采用經(jīng)典的Transwell?細胞小室培養(yǎng)Caco-2細胞單層膜的方法研究草甘膦的跨膜轉(zhuǎn)運特性。結(jié)果顯示草甘膦自A側(cè)到B側(cè)轉(zhuǎn)運速率要高于B側(cè)到A側(cè),提示其轉(zhuǎn)運過程中可能有轉(zhuǎn)運體參與。根據(jù)不同類型氨基酸轉(zhuǎn)運體在Caco-2細胞表達部位的差異,分別選取氨基酸轉(zhuǎn)運體底物(L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸)和抑制劑(BCH)從不同的轉(zhuǎn)運方向考察其對草甘膦
12、轉(zhuǎn)運的影響。實驗結(jié)果表明,氨基酸轉(zhuǎn)運體L系統(tǒng)底物或抑制劑均能顯著抑制草甘膦的轉(zhuǎn)運過程,推測草甘膦的轉(zhuǎn)運過程主要與L系統(tǒng)轉(zhuǎn)運體相關(guān)。但存在于A側(cè)的y+系統(tǒng)底物(L-賴氨酸)未對草甘膦的轉(zhuǎn)運產(chǎn)生影響(n=4,p<0.05),位于B側(cè)的b0,+系統(tǒng)屬于Na+依賴型轉(zhuǎn)運體,也未參與草甘膦的轉(zhuǎn)運。草甘膦屬于甘氨酸衍生物,此外還考察了不含磷酸根離子的HEPES溶液對草甘膦轉(zhuǎn)運的影響,結(jié)果表明依賴Na+離子和PO4-離子的磷酸轉(zhuǎn)運體未參與草甘膦的攝取
13、過程(n=4,p<0.05)??紤]到草甘膦轉(zhuǎn)運速率下降的多種原因,進一步采用熒光實時定量PCR與Western Blot方法,對Caco-2細胞上LAT1/2轉(zhuǎn)運體的基因表達和蛋白表達水平進行測定。結(jié)果表明在基因和蛋白水平,LAT1/2的表達量均未發(fā)生顯著變化(p<0.05),提示草甘膦以及氨基酸轉(zhuǎn)運體底物或抑制劑均不影響氨基酸轉(zhuǎn)運體LAT1/2的表達,草甘膦跨膜轉(zhuǎn)運速率的下降可能由于與底物發(fā)生了競爭性抑制。
為了判斷草甘膦能
14、否通過鼻腦通路進入腦部,選取KM小鼠鼻腔給藥方法,分別對草甘膦原料藥組、草甘膦原料藥與L-丙氨酸合用組以及市售Roundup?劑型組進行草甘膦經(jīng)鼻給藥后腦部藥動學研究,采用DAS?3.0藥動學軟件進行藥動學參數(shù)計算。結(jié)果表明,市售劑型組到達腦部的藥物量遠大于草甘膦原料藥組進入腦部的藥物量,LAT2特異性底物L-丙氨酸能顯著抑制其進入腦部的量。L系統(tǒng)轉(zhuǎn)運體在鼻腔黏膜上均有表達,推測L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運體可能參與了草甘膦經(jīng)鼻入腦的過程,提示草甘
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