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文檔簡(jiǎn)介
1、昆蟲很多重要的行為過(guò)程如躲避天敵、定位寄主、覓食、尋找配偶、選擇產(chǎn)卵位點(diǎn)以及調(diào)節(jié)種群密度等,都與其高度靈敏的嗅覺系統(tǒng)密不可分,其中觸角是昆蟲最重要的嗅覺器官,分布有大量的嗅覺感器。昆蟲的嗅覺過(guò)程在外周水平上概括為:環(huán)境中的疏水性氣味分子首先通過(guò)感器壁上的微孔擴(kuò)散進(jìn)入感器腔,然后由氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding protein,OBP)選擇性結(jié)合并運(yùn)送至嗅覺感受神經(jīng)元(Olfactorysensory neuron,OSN)
2、樹突表面上的特定嗅覺受體(Olfactory receptor, OR)部位,此處氣味分子激活受體并進(jìn)一步啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終完成化學(xué)信號(hào)到電信號(hào)的轉(zhuǎn)換。上述過(guò)程涉及多種蛋白的參與,主要包括氣味結(jié)合蛋白、化學(xué)感受蛋白(Chemosensoryprotein,CSP)、氣味受體和氣味降解酶(Odorant degrading enzyme,ODE)等。德國(guó)小蠊(Blattella germanica)屬蜚蠊目Blattaria、姬蠊科Bla
3、ttidae、小蠊屬Blattella,是世界性衛(wèi)生害蟲,對(duì)其嗅覺相關(guān)基因進(jìn)行鑒定并進(jìn)一步研究其分子機(jī)制,不僅有助于闡明昆蟲化感基因的進(jìn)化,也可為基于嗅覺調(diào)控的環(huán)境友好型防治新技術(shù)的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供理論指導(dǎo),但迄今僅見一篇有關(guān)德國(guó)小蠊幾個(gè)化感相關(guān)基因鑒定的報(bào)道。本文基于德國(guó)小蠊觸角的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,綜合利用分子生物學(xué)與生物信息學(xué)技術(shù),對(duì)化感相關(guān)基因進(jìn)行了大批量鑒定,共得到82個(gè)相關(guān)基因,其中71個(gè)是首次報(bào)道。在基因鑒定的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用RT
4、-PCR和qPCR等方法,檢測(cè)了這些化感基因在mRNA水平上的組織及性別表達(dá)特點(diǎn),獲得了一批觸角特異或高表達(dá)基因,為后續(xù)研究這些基因的功能及明確德國(guó)小蠊的嗅覺機(jī)制奠定了基礎(chǔ);此外還發(fā)現(xiàn),一半以上的化感相關(guān)基因在尾須中有表達(dá),暗示尾須可能具有化感功能。主要結(jié)果如下:
1.德國(guó)小蠊觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析
通過(guò)Illumina HiSeqTM2000高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序了德國(guó)小蠊的觸角轉(zhuǎn)錄組,獲得轉(zhuǎn)錄組堿基數(shù)總量約4
5、.81GB,測(cè)序拼接后得到47,925個(gè)Unigene,其中19,099個(gè)Unigene能夠成功比對(duì)上已報(bào)道物種的相應(yīng)基因。在這19,099個(gè)成功比對(duì)的Unigene中,比對(duì)比例最高的是赤擬谷盜(Tribolium castaneum)為14.08%,隨后依次是體虱(Pediculus humanus corporis)12.16%,苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata)6.19%,麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitr
6、ipennis)5.24%,豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)4.60%。利用BLAST2GO對(duì)Unigene進(jìn)行GO功能注釋,結(jié)果有9,491個(gè)Unigene可以進(jìn)行GO分類,其中累計(jì)歸到生物學(xué)過(guò)程(biological process)不同亞類的共有37,299個(gè)基因次,占比前兩位的亞類是細(xì)胞代謝過(guò)程(占比62.05%)和生物體代謝過(guò)程(49.76%);歸到細(xì)胞組分(cellular component)不同亞類的共有
7、21,080個(gè)基因次,占比前兩位的亞類是細(xì)胞(46.98%)和細(xì)胞組成(46.98%);歸到分子功能(molecular function)不同亞類的共有11,959個(gè)基因次,占比前兩位的亞類是結(jié)合(50.52%)和催化活性(50.15%)。大量基因的獲得為研究德國(guó)小蠊的化學(xué)感受及其他生理過(guò)程的分子機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)。
2.德國(guó)小蠊化學(xué)感受相關(guān)基因的鑒定和序列分析
基于德國(guó)小蠊觸角轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù),通過(guò)Blastx同源比
8、對(duì)搜索,共鑒定出82個(gè)化學(xué)感受相關(guān)基因,包括48個(gè)氣味結(jié)合蛋白(OBP)基因、9個(gè)化學(xué)感受蛋白(CSP)基因、6個(gè)感受神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因、5個(gè)氣味受體(OR)基因、5個(gè)離子型受體(ionotropic receptor,IR)基因和9個(gè)味覺受體(gustatory receptor,GR)基因,其中有71個(gè)基因(包括42個(gè)OBP、5個(gè)CSP、6個(gè)SNMP、4個(gè)OR
9、、5個(gè)IR和9個(gè)GR)為本文首次報(bào)道。在德國(guó)小蠊中,Plus-C OBP數(shù)量占所有OBP基因總數(shù)的40%,該比例遠(yuǎn)高于黑腹果蠅的24%(12個(gè))、家蠶的11%(5個(gè))以及赤擬谷盜的2%(1個(gè)),表明Plus-C OBP在OBP總數(shù)量的占比并非隨物種進(jìn)化程度的增高而增高。
3.德國(guó)小蠊化學(xué)感受相關(guān)基因的表達(dá)譜研究
表達(dá)譜分析可以為基因功能提供重要線索。利用RT-PCR進(jìn)行組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn):1)48個(gè)OBP基因中,只有
10、OBP13為觸角特異表達(dá);OBP6、15和28為觸角高表達(dá);11個(gè)OBP基因(OBP4-5、7、25-26、34-36、39-40和42)僅僅在觸角、頭(或觸角、尾須)中表達(dá);10個(gè)OBP基因(OBP3、16、20、27、32、38、41、43和45-46)在所有被測(cè)組織中都有表達(dá)。2)9個(gè)CSP基因中,只有CSP9表現(xiàn)出一定的觸角特異性;CSP1和CSP3在除頭、胸外的所有組織中表達(dá);其他6個(gè)基因則在所有被測(cè)組織中都有表達(dá);3)6個(gè)S
11、NMP基因中,SNMP1b和SNMP1c僅在觸角表達(dá);SNMP1a在所有檢測(cè)組織中都有較高表達(dá)。4)5個(gè)OR基因中,Orco(OR1)為觸角特異表達(dá);OR2為觸角高表達(dá);另3個(gè)OR基因?yàn)槎喾N組織表達(dá)。5)5個(gè)IR基因中,IR1,IR3和IR5為觸角顯著高表達(dá),而IR4幾乎在所有組織中都有表達(dá)。6)多于一半的的化感基因在尾須中表達(dá),暗示尾須除具有機(jī)械感受外功能外,可能還具有化感功能。7)進(jìn)一步對(duì)8個(gè)基因的qPCR分析發(fā)現(xiàn),所測(cè)基因均表現(xiàn)為
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