酪蛋白-角蛋白自組裝復(fù)合膠束的可控制備及應(yīng)用性能研究.pdf

1、目前合成高分子材料在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，其不但消耗有限的石油資源，且難以自然降解，產(chǎn)生的污染物對(duì)環(huán)境會(huì)造成嚴(yán)重的破壞。正因?yàn)槿绱耍陙硖烊桓叻肿硬牧献鳛橐环N可降解的環(huán)境友好型材料越來越多的得到了人們的重視。蛋白質(zhì)屬于天然高分子化合物，目前人們已經(jīng)利用其自組裝特性來制備納米材料和具有新功能特性的材料。本課題主要涉及兩種天然蛋白質(zhì)：酪蛋白與角蛋白。為了以這兩種蛋白為模型研究生物體外不同蛋白之間自組裝規(guī)律，拓展通過自組裝技術(shù)制備以酪蛋

2、白為基礎(chǔ)的應(yīng)用型復(fù)合膠束，本課題使用酪蛋白與角蛋白這兩種不同的蛋白，通過控制組裝條件制備出形貌、粒徑及親疏水性可控型復(fù)合膠束，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、特性及形成機(jī)理進(jìn)行了研究，并且對(duì)其在生物膜制備及藥物緩釋方面的應(yīng)用性能進(jìn)行了初步探討，為今后深入系統(tǒng)的研究可控型蛋白復(fù)合膠束打下了一定的基礎(chǔ)，主要研究工作包括以下幾個(gè)方面：
　　(1)采用Na2S還原法制備含有巰基的角蛋白溶液，采用酸沉淀法對(duì)其進(jìn)行了分離，采用等電聚焦，超濾與透析的方法提純了不同

3、等電點(diǎn)的羊毛角蛋白。研究了體系沉淀pH值、沉淀溫度及沉淀時(shí)間對(duì)角蛋白產(chǎn)率的影響。結(jié)果顯示，羊毛角蛋白在體系pH值為2.0，沉淀溫度為5℃，沉淀時(shí)間為3h的條件下產(chǎn)率最大，達(dá)到62.8％。研究了不同等電點(diǎn)羊毛角蛋白的分布與產(chǎn)率。依據(jù)組裝需要選擇了等電點(diǎn)為3.0和5.5的角蛋白組分作為組裝材料，這兩種角蛋白的產(chǎn)率分別為12.5%及5.8%。其半胱氨酸含量分別為21.45%及2.57%，重均分子量分別為13355Da和6191Da。此法得到的

4、可溶角蛋白分子量較大，結(jié)構(gòu)比較完整，鏈段活性基團(tuán)較多，具備了與酪蛋白形成典型自組裝復(fù)合膠束的能力。
　　(2)采用二硫鍵固定法及酶固定法分別制備了穩(wěn)定的酪蛋白/角蛋白 pI3.0組分納米復(fù)合膠束及酪蛋白/角蛋白 pI5.5組分復(fù)合膠束。采用掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射法、微分熱重法等對(duì)復(fù)合膠束特性進(jìn)行了表征。在組裝溫度為20℃，酪蛋白與角蛋白質(zhì)量比為4:1，酪蛋白/角蛋白pI3.0組分與酪蛋白/角蛋白pI5.5組分蛋白

5、濃度分別為1.5mg/mL及3mg/mL時(shí)，所組裝制備的復(fù)合膠束呈球形。酪蛋白/角蛋白 pI3.0組分復(fù)合膠束的粒徑范圍在50~80nm之間，酪蛋白/角蛋白pI5.5組分復(fù)合膠束的粒徑范圍在100~200nm之間。復(fù)合固定前后其熱性能發(fā)生了顯著變化。經(jīng)過氧化固定法制備的酪蛋白/角蛋白pI3.0組分復(fù)合膠束其熱穩(wěn)定性要高于經(jīng)過酶固定法制備的酪蛋白/角蛋白pI5.5組分復(fù)合膠束。復(fù)合膠束具有良好的稀釋穩(wěn)定性、存儲(chǔ)穩(wěn)定性、凍干穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性

6、。酪蛋白/角蛋白pI5.5組分復(fù)合膠束制備過程中可以形成分子量范圍在43~200KDa的大分子聚合物。
　　(3)通過控制蛋白溶液組裝濃度和組裝質(zhì)量比制備了球形、立方體形、蠕蟲形、囊泡形、海膽形、珊瑚簇狀和混雜形貌的復(fù)合膠束。通過控制鏈段組成，制備了酪蛋白/角蛋白pI3.0組分復(fù)合納米膠束及粒徑范圍在100~200nm范圍內(nèi)的酪蛋白/角蛋白pI5.5組分復(fù)合膠束。當(dāng)增加蛋白濃度及減小酪蛋白與角蛋白組裝質(zhì)量比時(shí)，可以制備疏水性逐漸增

7、強(qiáng)的復(fù)合膠束。當(dāng)組裝溫度從20℃逐漸增加到60℃時(shí)，復(fù)合膠束會(huì)從球形轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎襟w形，其親水性會(huì)不斷增強(qiáng)。
　　(4)酪蛋白與角蛋白分子鏈在溶液中聚集形成復(fù)合膠束的過程分為靜電復(fù)合、親疏水性相互作用形成殼核結(jié)構(gòu)及膠束結(jié)構(gòu)固定三個(gè)階段。在固定酪蛋白/角蛋白pI3.0組分復(fù)合膠束時(shí)會(huì)涉及到巰基的氧化及雙硫鍵的重建過程，所形成的雙硫鍵網(wǎng)絡(luò)可以將酪蛋白組分穿插固定。在固定酪蛋白/角蛋白pI5.5組分復(fù)合膠束時(shí)會(huì)涉及到不同蛋白分子之間酰胺交聯(lián)

8、鍵的形成過程。對(duì)酪蛋白與角蛋白分子鏈在溶液中聚集形成復(fù)合膠束的過程進(jìn)行了介觀動(dòng)力學(xué)模擬，同時(shí)發(fā)現(xiàn)酪蛋白與角蛋白 pI3.0組分組裝體系能較快地達(dá)到體系平衡。使用拉曼光譜、遠(yuǎn)紫外及近紫外 CD光譜對(duì)復(fù)合膠束形成過程中蛋白分子二、三級(jí)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，同時(shí)，對(duì)制備的復(fù)合膠束在不同pH值及溫度下蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示當(dāng)酪蛋白與角蛋白 pI3.0組分質(zhì)量比為4:1時(shí)，所形成的復(fù)合膠束中肽鏈α-螺旋和β-折疊比例較高

9、，所形成的復(fù)合膠束二、三級(jí)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，并且在pH值6.0~11.0，溫度20~50℃的范圍內(nèi)具有較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
　　(5)將制備的酪蛋白/角蛋白 pI5.5組分納米復(fù)合膠束用于制備生物膜，通過低濃度制備組裝復(fù)合膠束溶液，再濃縮至高濃度的方法制備了酪蛋白/角蛋白pI5.5組分復(fù)合膠束膜。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過組裝程序制備的復(fù)合膠束膜比未經(jīng)過組裝制備的復(fù)合膠束膜，機(jī)械性能得到了提高，其中當(dāng)酪蛋白與角蛋白組裝質(zhì)量比為4:1時(shí)，伸長率提高了3

10、8%，抗張強(qiáng)度提高了32%。組裝效應(yīng)使膜表面疏水性得到了提高，膜的水汽透過率、透氣性、總?cè)芙馕镆约巴腹饴手笜?biāo)降低。經(jīng)過組裝制備的復(fù)合膠束膜的斷面結(jié)構(gòu)要比未經(jīng)過組裝制備的膜致密且光滑。膜的有關(guān)性能的改變與復(fù)合膠束的結(jié)構(gòu)與聚集模式存在密切的聯(lián)系，質(zhì)量比為4:1時(shí)所形成的球形復(fù)合膠束對(duì)膜的性能及表觀結(jié)構(gòu)改變效果最為顯著。
　　(6)將制備的酪蛋白/角蛋白 pI3.0組分納米復(fù)合膠束用于包埋疏水性藥物β–胡蘿卜素。結(jié)果顯示，包埋有β–胡蘿