基于異喹啉生物堿的核酸識(shí)別及應(yīng)用研究.pdf

1、人體內(nèi)疾病大多與基因相關(guān)，因此生物堿與DNA相互作用的研究一直受到科學(xué)家的關(guān)注。天然異喹啉生物堿豐富存在于藥用植物物種中，尤其是具有原小檗堿和苯并菲啶基團(tuán)的天然異喹啉生物堿，在生物學(xué)上和抗微生物、抗炎、抗氧化和抗癌等治療活性上具有很重要的作用。它們的活性與核酸的結(jié)合密切相關(guān)。盡管生物堿和DNAs（雙鏈DNA、脫堿基位點(diǎn)DNA、G-四鏈體和三鏈體）、RNAs的相互作用已被廣泛研究，但是并沒(méi)有關(guān)于核酸和生物學(xué)上很重要的異喹啉生物堿的高特異性

2、和緊密性結(jié)合的報(bào)道。因?yàn)檫@些異喹啉生物堿（尤其是原小檗堿基團(tuán)）大部分是不發(fā)熒光的，而且具有相似的分子量和結(jié)構(gòu)框架，尋找能夠使其熒光增強(qiáng)的DNA是很有必要的，尤其是利用免標(biāo)記熒光技術(shù)?；诖?，本論文選用不同取代結(jié)構(gòu)的異喹啉類生物堿來(lái)識(shí)別人類端粒G-四鏈體、脫堿基位點(diǎn)DNA、triplex DNA。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用的方法快速、靈敏、選擇性好、背景低。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.基于適配體開(kāi)關(guān)的表小檗堿熒光增強(qiáng)高選擇性計(jì)量識(shí)別人類端粒G-

3、四鏈體多聚體
　　人類端粒G-四鏈體可作為開(kāi)關(guān)天然異喹啉生物堿熒光的潛在適配體。我們研究發(fā)現(xiàn)G-四鏈體和一系列結(jié)構(gòu)相似的生物堿中，只有人類端粒G-四鏈體是最有效的熒光轉(zhuǎn)換適配體，尤其是G-四鏈體5'末端是5'-TA-3'殘基(5'-TAG3(TTAG3)3-3'，TA[Q]，作為最短的序列）可以選擇性的增強(qiáng)表小檗堿(EPI)的熒光。EPI和TA[Q]的親和力比其他的小分子要強(qiáng)20倍，EPI和TA[Q]的解離常數(shù)是37nM。穩(wěn)態(tài)吸收

4、、穩(wěn)態(tài)、時(shí)間分辨熒光和核磁共振表明EPI很有可能和5'末端側(cè)翼序列發(fā)生作用，相比于其他生物堿用一種更特殊的方式堆疊在[Q]及G-四鏈體上。EPI和適配體的高選擇性及緊密性結(jié)合，EPI和DNA結(jié)合之后很高的熒光響應(yīng)表明選擇性識(shí)別EPI傳感器的發(fā)展?jié)摿?。更重要的是，EPI可作為人類端粒G-四鏈體構(gòu)象的有效探針，鑒別DNA G-四鏈體和RNAG-四鏈體。而且，EPI在所有的生物堿中發(fā)光是最強(qiáng)的。EPI是按一定化學(xué)計(jì)量比結(jié)合到G-四鏈體單元上的

5、，隨著端粒DNA G-四鏈體多聚體長(zhǎng)度的增加，其體系熒光強(qiáng)度也會(huì)成比例增強(qiáng)，這表明EPI將來(lái)可以作為生物成像探針和治療性的DNA結(jié)合劑。
　　2.利用異喹啉生物堿特異性識(shí)別脫堿基位點(diǎn)DNA
　　利用異喹啉生物堿小分子特異性識(shí)別脫堿基位點(diǎn)DNA(AP DNA)，異喹啉生物堿和AP DNA特異性結(jié)合之后，熒光增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)免標(biāo)記DNA堿基識(shí)別。當(dāng)AP位點(diǎn)側(cè)翼堿基為A，對(duì)位堿基為C時(shí)，熒光增強(qiáng)明顯。因此，利用異喹啉生物堿作為熒光探針，

6、在目標(biāo)堿基對(duì)面放置AP位點(diǎn)，能夠發(fā)展為檢測(cè)腺嘌呤和胞嘧啶的一種新方法。
　　3.異喹啉生物堿識(shí)別triplex DNA
　　通過(guò)Tm測(cè)試來(lái)檢測(cè)triplex DNA的形成，利用異喹啉生物堿識(shí)別triplexDNA，然后再通過(guò)生物堿和triplex DNA以及雙鏈DNA熒光強(qiáng)度的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)白屈菜紅堿(CHE)對(duì)triplex DNA有較好的熒光響應(yīng)而對(duì)雙鏈DNA熒光響應(yīng)很小，同時(shí)自身背景很低。CHE和triplex DNA結(jié)合