高分辨受激拉曼光譜顯微成像及應(yīng)用研究.pdf

1、受激拉曼散射（stimulated Raman scattering,SRS）顯微成像技術(shù)是一種新興的無(wú)標(biāo)記顯微成像技術(shù)，其成像襯度來(lái)源于分子振動(dòng)特性，因而具有優(yōu)異的化學(xué)選擇性和化學(xué)特異性。除此之外，由于SRS顯微成像具有高分辨率、高靈敏度和無(wú)侵入性等特點(diǎn)，在不到十年的時(shí)間里已經(jīng)發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的一項(xiàng)重要工具。基于高光譜SRS和多元SRS的受激拉曼光譜顯微成像更是在每一個(gè)像素點(diǎn)都擁有一段光譜，因此其不僅可以區(qū)分擁有重疊拉曼譜帶

2、的不同分子，還能提供更加豐富的化學(xué)信息，成為最近兩三年來(lái)研究的前沿和熱點(diǎn)。然而受發(fā)展時(shí)間限制，目前受激拉曼光譜顯微成像的研究還有很多方面需要完善，其應(yīng)用仍然需要開(kāi)拓。鑒于此，本文利用光譜聚焦以及非線性光譜壓縮和脈沖整形相結(jié)合的方法開(kāi)展了高分辨受激拉曼光譜成像技術(shù)以及其在膜電位檢測(cè)和木質(zhì)素化學(xué)成分分析中的應(yīng)用研究。
　　理論上，本文首先利用非線性耦合波方程對(duì)SRS信號(hào)的產(chǎn)生過(guò)程進(jìn)行了推導(dǎo)，給出了SRS信號(hào)的表達(dá)式。分析并比較了不同非

3、共振背景下的SRS和CARS光譜線型的差異。研究了入射激光偏振對(duì)不同退偏比拉曼振動(dòng)模SRS信號(hào)強(qiáng)度的影響，揭示了偏振調(diào)制SRS成像的基本原理。詳細(xì)討論了SRS成像中的噪聲、信噪比以及背景等問(wèn)題，指出在理想情況下SRS顯微成像系統(tǒng)應(yīng)具有散粒噪聲極限探測(cè)能力。
　　分析了光譜聚焦方法實(shí)現(xiàn)高光譜相干拉曼散射顯微成像的機(jī)理，并利用玻璃棒引入線性啁啾建立了一套基于光譜聚焦方法的高光譜SRS顯微成像系統(tǒng)，針對(duì)該方法中存在的拉曼頻移校準(zhǔn)和信號(hào)強(qiáng)

4、度校準(zhǔn)問(wèn)題，給出了具體的解決方案。同時(shí)在應(yīng)用研究方面，首次探討了利用SRS信號(hào)無(wú)標(biāo)記探測(cè)細(xì)胞膜電位的可行性。以紅細(xì)胞血影為模型，完成了單個(gè)自然細(xì)胞膜的振動(dòng)光譜成像，證實(shí)了高光譜SRS顯微成像探測(cè)單個(gè)細(xì)胞膜的靈敏度。通過(guò)操控細(xì)胞膜內(nèi)外離子成分改變跨膜電位，同時(shí)利用受激拉曼光譜成像觀察不同電勢(shì)下的細(xì)胞膜，發(fā)現(xiàn)SRS光譜線型隨膜電位改變發(fā)生顯著變化，結(jié)果表明SRS成像有望用于細(xì)胞膜電位的無(wú)標(biāo)記測(cè)量。
　　考慮光譜聚焦方法光譜分辨率較差，

5、難以滿足指紋區(qū)的成像應(yīng)用，而脈沖整形技術(shù)又不能有效利用激勵(lì)激光功率，通過(guò)理論分析非線性光譜壓縮機(jī)理和總結(jié)已報(bào)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)方案，開(kāi)發(fā)了一套靈活、緊湊的非線性光譜壓縮裝置，該裝置可將寬帶飛秒激光線寬壓縮至幾個(gè)波數(shù)，同時(shí)維持一半以上的激光功率，利用搭建的非線性光譜壓縮裝置所提供的高功率斯托克斯激勵(lì)光源，分別在指紋區(qū)和靜默區(qū)建立了兩套光譜分辨率優(yōu)于10cm-1的高光譜SRS顯微成像系統(tǒng)，同時(shí)在靜默區(qū)系統(tǒng)中改進(jìn)了光譜掃描裝置，設(shè)計(jì)了一種基于檢流計(jì)振鏡

6、的新型脈沖內(nèi)部光譜掃描器。針對(duì)當(dāng)前高光譜SRS成像主要用于動(dòng)物細(xì)胞、組織和模型生物研究的現(xiàn)狀，利用分子指紋振動(dòng)，開(kāi)展了高光譜SRS顯微成像用于分析描繪木質(zhì)素化學(xué)成分分布的研究。以擬南芥作為模型，運(yùn)用高光譜SRS顯微成像觀察對(duì)比轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥，確立了高光譜SRS顯微成像定量區(qū)分木質(zhì)素中不同化學(xué)組份并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)木質(zhì)素化學(xué)成分變化的能力。將研究進(jìn)一步拓展至長(zhǎng)狗尾草和玉米秸稈，利用高光譜SRS顯微成像觀察維管束內(nèi)纖維細(xì)胞，結(jié)合多元曲線

7、分辨（multivariate curve resolution,MCR）分析，首次揭示了木質(zhì)素中醇和醛兩種不同組份在植物細(xì)胞壁內(nèi)的漸變分布。
　　最后，針對(duì)目前多元SRS成像光譜探測(cè)范圍較窄的問(wèn)題，提出了一種利用反向啁啾脈沖實(shí)現(xiàn)多元SRS顯微成像的新方法，利用玻璃棒和光柵對(duì)分別對(duì)泵浦光和斯托克斯光引入正、負(fù)啁啾，建立了一套基于反向啁啾脈沖的多元SRS顯微成像系統(tǒng)，同時(shí)通過(guò)對(duì)DMSO樣品進(jìn)行成像觀察，驗(yàn)證了該方法的可行性。