高分辨受激拉曼光譜顯微成像及應用研究.pdf

1、受激拉曼散射（stimulated Raman scattering,SRS）顯微成像技術是一種新興的無標記顯微成像技術，其成像襯度來源于分子振動特性，因而具有優(yōu)異的化學選擇性和化學特異性。除此之外，由于SRS顯微成像具有高分辨率、高靈敏度和無侵入性等特點，在不到十年的時間里已經發(fā)展成為生命科學領域研究中的一項重要工具?；诟吖庾VSRS和多元SRS的受激拉曼光譜顯微成像更是在每一個像素點都擁有一段光譜，因此其不僅可以區(qū)分擁有重疊拉曼譜帶

2、的不同分子，還能提供更加豐富的化學信息，成為最近兩三年來研究的前沿和熱點。然而受發(fā)展時間限制，目前受激拉曼光譜顯微成像的研究還有很多方面需要完善，其應用仍然需要開拓。鑒于此，本文利用光譜聚焦以及非線性光譜壓縮和脈沖整形相結合的方法開展了高分辨受激拉曼光譜成像技術以及其在膜電位檢測和木質素化學成分分析中的應用研究。
　　理論上，本文首先利用非線性耦合波方程對SRS信號的產生過程進行了推導，給出了SRS信號的表達式。分析并比較了不同非

3、共振背景下的SRS和CARS光譜線型的差異。研究了入射激光偏振對不同退偏比拉曼振動模SRS信號強度的影響，揭示了偏振調制SRS成像的基本原理。詳細討論了SRS成像中的噪聲、信噪比以及背景等問題，指出在理想情況下SRS顯微成像系統(tǒng)應具有散粒噪聲極限探測能力。
　　分析了光譜聚焦方法實現高光譜相干拉曼散射顯微成像的機理，并利用玻璃棒引入線性啁啾建立了一套基于光譜聚焦方法的高光譜SRS顯微成像系統(tǒng)，針對該方法中存在的拉曼頻移校準和信號強

4、度校準問題，給出了具體的解決方案。同時在應用研究方面，首次探討了利用SRS信號無標記探測細胞膜電位的可行性。以紅細胞血影為模型，完成了單個自然細胞膜的振動光譜成像，證實了高光譜SRS顯微成像探測單個細胞膜的靈敏度。通過操控細胞膜內外離子成分改變跨膜電位，同時利用受激拉曼光譜成像觀察不同電勢下的細胞膜，發(fā)現SRS光譜線型隨膜電位改變發(fā)生顯著變化，結果表明SRS成像有望用于細胞膜電位的無標記測量。
　　考慮光譜聚焦方法光譜分辨率較差，

5、難以滿足指紋區(qū)的成像應用，而脈沖整形技術又不能有效利用激勵激光功率，通過理論分析非線性光譜壓縮機理和總結已報導的實驗方案，開發(fā)了一套靈活、緊湊的非線性光譜壓縮裝置，該裝置可將寬帶飛秒激光線寬壓縮至幾個波數，同時維持一半以上的激光功率，利用搭建的非線性光譜壓縮裝置所提供的高功率斯托克斯激勵光源，分別在指紋區(qū)和靜默區(qū)建立了兩套光譜分辨率優(yōu)于10cm-1的高光譜SRS顯微成像系統(tǒng)，同時在靜默區(qū)系統(tǒng)中改進了光譜掃描裝置，設計了一種基于檢流計振鏡

6、的新型脈沖內部光譜掃描器。針對當前高光譜SRS成像主要用于動物細胞、組織和模型生物研究的現狀，利用分子指紋振動，開展了高光譜SRS顯微成像用于分析描繪木質素化學成分分布的研究。以擬南芥作為模型，運用高光譜SRS顯微成像觀察對比轉基因擬南芥與野生型擬南芥，確立了高光譜SRS顯微成像定量區(qū)分木質素中不同化學組份并實時監(jiān)測木質素化學成分變化的能力。將研究進一步拓展至長狗尾草和玉米秸稈，利用高光譜SRS顯微成像觀察維管束內纖維細胞，結合多元曲線

7、分辨（multivariate curve resolution,MCR）分析，首次揭示了木質素中醇和醛兩種不同組份在植物細胞壁內的漸變分布。
　　最后，針對目前多元SRS成像光譜探測范圍較窄的問題，提出了一種利用反向啁啾脈沖實現多元SRS顯微成像的新方法，利用玻璃棒和光柵對分別對泵浦光和斯托克斯光引入正、負啁啾，建立了一套基于反向啁啾脈沖的多元SRS顯微成像系統(tǒng)，同時通過對DMSO樣品進行成像觀察，驗證了該方法的可行性。