基于TUDCA生物轉(zhuǎn)化的固定化酶填充床反應(yīng)器流場(chǎng)模擬及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前?；切苋パ跄懰幔═auroursodeoxycholic acid, TUDCA）主要利用人工提取熊膽汁的方式來(lái)獲得，但由于熊膽資源的稀缺性和來(lái)源的特殊性使 TUDCA的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床用藥需求。本文在本課題組提出的雙酶偶聯(lián)固定化酶促反應(yīng)生產(chǎn) TUDCA方法的基礎(chǔ)上，著眼于高效固定化酶生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)，應(yīng)用FLUENT軟件模擬分析了填充床反應(yīng)器內(nèi)的流場(chǎng)，探討了流速和反應(yīng)器高徑比對(duì)反應(yīng)器流場(chǎng)分布的影響，并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)模擬的結(jié)果

2、進(jìn)行驗(yàn)證和分析，獲得了能在一定程度上代替實(shí)驗(yàn)過(guò)程的CFD模型。研究將為進(jìn)一步反應(yīng)器的設(shè)計(jì)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本課題來(lái)源于項(xiàng)目編號(hào)為2014ZX09301306-007的國(guó)家科技重大專項(xiàng)新藥創(chuàng)制項(xiàng)目，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　?、賾?yīng)用 pGEX-6p-1和 GST融合基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)7α-羥基類固醇脫氫酶(7α-HSDH)和7β-羥基類固醇脫氫酶(7β-HSDH)進(jìn)行了表達(dá)和純化，并以殼聚糖為載體對(duì)7α-HSDH和7β-

3、HSDH進(jìn)行了固定。1)通過(guò) GST一步親和純化獲得了7α-HSDH和7β-HSDH游離酶，電泳分析為具有唯一清晰且較寬的條帶，酶的濃度分別為1.776mg/mL和2.059mg/mL，酶比活分別為24.16U/mg和49.36U/mg。2)應(yīng)用戊二醛活化的殼聚糖微球?qū)?α-HSDH和7β-HSDH進(jìn)行固定化，結(jié)果表明兩種酶的固定率均大于98％。
　　②利用雙酶偶聯(lián)共固定對(duì)TUDCA進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，優(yōu)化獲得了該雙酶偶聯(lián)共固定系統(tǒng)的適

4、宜pH值、溫度和底物濃度，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究確定了酶促反應(yīng)的最佳參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)pH值在7到11范圍內(nèi)變化，固定化酶對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化效率為pH9＞Ph11＞Ph10＞pH8＞pH7，因此最適pH值為9。2)當(dāng)溫度從5℃到60℃變化時(shí)，固定化酶催化效率先緩慢升高，然后急劇降低，固定化酶對(duì) TUDCA轉(zhuǎn)化效率為25℃＞15℃＞5℃＞37℃＞45℃＞60℃，因此最適溫度為25℃。3)當(dāng)?shù)孜餄舛葟?mM到25mM變化時(shí)，固定化酶催化能力先增

5、強(qiáng)，后減弱，固定化酶對(duì)TUDCA轉(zhuǎn)化效率為10mM＞15mM＞20mM＞25Mm＞5Mm，因此最適底物濃度為10mM。
　?、蹜?yīng)用FLUENT6.3軟件對(duì)填充床反應(yīng)器的流場(chǎng)進(jìn)行了模擬分析，研究了循環(huán)流速和反應(yīng)器高徑比對(duì)流場(chǎng)的影響。我們發(fā)現(xiàn)：1)當(dāng)反應(yīng)器高徑比一定時(shí)，流場(chǎng)的均勻性隨著流速的增大而增大，這將使底物與酶的接觸越充分，越有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。2)在一定流速下，改變高徑比，高徑比越大，液體流過(guò)的相對(duì)橫截面積相同，但是液體在反

6、應(yīng)器中的滯留時(shí)間越長(zhǎng)，致使底物與酶接觸時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。
　?、懿捎霉潭ɑ柑畛浯卜磻?yīng)器研究驗(yàn)證了循環(huán)流速和反應(yīng)器高徑比對(duì)TUDCA生物轉(zhuǎn)化的影響。1)在高徑比為30:16，循環(huán)流速分別為1mL/min,2mL/min,4mL/min的反應(yīng)器中，通過(guò)比較體積生產(chǎn)效率，結(jié)果表現(xiàn)為4mL/min＞2mL/min＞1mL/min，與模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。2)在流速為2mL/min，高徑比分別為30:16,60:16,100: