浸礦微生物硫酸鹽同化與重金屬抗性耦合作用機(jī)制的研究.pdf

1、我國礦產(chǎn)資源的顯著特點(diǎn)是品位低、復(fù)雜、難處理和中小型礦居多，傳統(tǒng)的選冶工藝很難進(jìn)行經(jīng)濟(jì)、綠色、有效地提取。生物冶金具有低成本、短流程、污染小等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。浸礦微生物浸出一段時(shí)間之后，其生長(zhǎng)的環(huán)境中就會(huì)富含高濃度的硫酸鹽及有毒重金屬離子，這是制約其浸出時(shí)間、浸出效率的重要的環(huán)境因素。而在微生物的解毒機(jī)制中，硫酸鹽的同化途徑可能發(fā)揮了重要的作用，因而對(duì)于浸礦微生物重金屬的抗性機(jī)制，以及硫酸鹽同化與重金屬解毒耦合作用機(jī)制的研究，

2、對(duì)微生物適應(yīng)極端環(huán)境的分子機(jī)制的揭示，對(duì)浸礦過程中，重金屬的耐受和浸礦效率的提高，以及在環(huán)境領(lǐng)域更廣闊的應(yīng)用其抗性機(jī)制，都將具有非常重要的意義。
　　 本文旨在對(duì)浸礦微生物的重金屬抗性機(jī)制進(jìn)行深入的探索，研究浸礦微生物的重金屬抗性以及與硫酸鹽同化的內(nèi)在聯(lián)系，研究工作主要有以下幾個(gè)方面:
　　 ①浸礦微生物重金屬抗性機(jī)制的初步探索
　　 在本研究給定的重金屬濃度下，A.ferooxidans表現(xiàn)出了明顯的抑制作用并

3、且隨著重金屬濃度的增加，抑制作用越明顯。適合研究的Cd2+、Zn2+、pb2+三種重金屬耐受濃度分別為Cd2+(5 mM、15 mM、30 mM)，Zn2+(150 mM、300 mM、600 mM)，Pb2+(2.5 mM、5 mM、10 mM)。在Cd2+脅迫下，通過測(cè)定鎘離子的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)鎘離子含量、細(xì)菌細(xì)胞體內(nèi)GSH的含量、硫酸根離子濃度、硫酸鹽同化途徑的相關(guān)酶類的酶活，結(jié)果表明其可能存在的抗性機(jī)制有細(xì)胞累積、排出系統(tǒng)、以及生物轉(zhuǎn)

4、化或螯合等幾種方式。
　　 在Zn2+脅迫下，通過測(cè)定菌體內(nèi)GSH的含量、Cys含量、硫酸鹽同化途徑的相關(guān)酶類酶活，結(jié)果表明，隨著pb2+濃度的增加，其體內(nèi)GSH含量有所增加，Cys含量的變化不明顯，硫酸鹽同化途徑的相關(guān)酶類也有所變化，但是卻是表現(xiàn)為先增加后降低，說明硫酸鹽同化途徑可能對(duì)鋅離子的抗性有一定的作用，但是在濃度更大的情況下，硫酸鹽同化途徑可能已經(jīng)不能滿足細(xì)菌菌體的需要，其可能啟動(dòng)了更多的重金屬抗性機(jī)制。
　　

5、 在pb2+的脅迫下，通過測(cè)定菌體內(nèi)GSH的含量、Cys含量、硫酸鹽同化途徑的相關(guān)酶類的酶活，結(jié)果表明，谷胱甘肽、半胱氨酸的含量，隨著pb2+濃度的增大而降低，硫酸鹽同化相關(guān)酶類的活性有所變化但是卻與Cd2+的情況相反，說明Pb2+脅迫菌體情況下硫酸鹽同化對(duì)抗性的貢獻(xiàn)可能不明顯，或是與Cd2+相反。
　　 ②浸礦微生物重金屬抗性基因的差異表達(dá)分析
　　 通過生物信息學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)了十個(gè)可能與重金屬抗性相關(guān)的基因。利用Re

6、al-time PCR技術(shù)，對(duì)Cd2+脅迫下重金屬抗性基因的差異表達(dá)情況進(jìn)行了考查，結(jié)果表明，在不同濃度的Cd2+刺激下，重金屬抗性基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量，均呈上調(diào)趨勢(shì)，相對(duì)對(duì)照組大約上調(diào)了1-8倍，且隨著Cd2+濃度的增加，上調(diào)倍數(shù)也隨之增加。預(yù)測(cè)Cd2+的轉(zhuǎn)運(yùn)模型為Czc操縱子是由H+離子梯度驅(qū)動(dòng)，由位于內(nèi)膜上的CzcA1，2A.f將重金屬Cd(Ⅱ)泵出到細(xì)胞質(zhì)，然后由CzcB1 A.f將重金屬穿梭至外膜，并預(yù)防重金屬進(jìn)入周質(zhì)，C

7、zcB1 A.f也可以提供其他重金屬的特異性。CzcC1A.f則完成將重金屬排出到外部環(huán)境的全過程。CmtR是重金屬的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，位于胞內(nèi)，作為識(shí)別的信號(hào)。CadB1 A.f和CadB2A.f是轉(zhuǎn)運(yùn)體，幫助CzcB1 A.f將重金屬運(yùn)出體外。
　　 在Zn2+脅迫下，重金屬抗性基因的表達(dá)差異情況結(jié)果表明，在不同濃度的Zn2+脅迫下，重金屬抗性基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量也是呈上調(diào)趨勢(shì)，大約是對(duì)照組的1.2到630倍，且隨著Zn2+

8、濃度的增加，上調(diào)倍數(shù)也隨之增加，說明這些基因的表達(dá)情況，大部分與Cd2+脅迫下情況相似。但是CzcABCAf重金屬排出系統(tǒng)的基因(AFE-0671 CzcA1A.f、AFE-1144 CzcA2A.f、 AFE-1142 CzcC1A.f和AFE-1143 CzcB1A.f)變化不大，說明對(duì)于Zn2+的抗性的貢獻(xiàn)可能不是很大，而基因AFE-2437 CadB1A.f、 AFE-2438 CadB2A.f、 AFE-2920 CadB3A

9、.f這三個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在Zn2+脅迫下，卻是隨著重金屬濃度的增大而逐漸增加的，說明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于鋅離子的抗性貢獻(xiàn)較大。
　　 在pb2+脅迫下，重金屬抗性基因的表達(dá)差異情況研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的pb2+脅迫下，重金屬抗性基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢(shì)，且隨著pb2+濃度的增加，并沒有明顯的調(diào)控趨勢(shì)，說明在pb2+脅迫下大多數(shù)抗性基因，沒有表現(xiàn)出明顯的調(diào)控或者為負(fù)調(diào)控。
　　 ③重金屬脅迫下硫酸鹽同化途徑相關(guān)基因的表達(dá)差

10、異分析
　　 通過生物信息學(xué)分析，找尋到硫酸鹽同化的相關(guān)的關(guān)鍵基因，對(duì)其進(jìn)行體外重組表達(dá)和酶活分析，確定了硫酸鹽同化的基本代謝路徑。被運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)的硫酸鹽被cysDN編碼的ATP硫酸化酶激活為APS(adenosine-5'-phosphosulfate)，隨后被APS還原酶還原為亞硫酸鹽，亞硫酸鹽又被cysJI編碼的亞硫酸鹽還原酶還原為硫化物，最后硫化物與O-乙酰絲氨酸由cysM編碼的半胱氨酸合成酶同化入半胱氨酸。
　　

11、 通過對(duì)重金屬脅迫下硫酸鹽同化途徑相關(guān)基因的表達(dá)差異分析，結(jié)果表明在Cd2+脅迫下，硫酸鹽同化的相關(guān)基因的表達(dá)，表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì)，大約是對(duì)照組的1到3倍，隨著離子濃度的增大，上調(diào)倍數(shù)越大。但是鋅離子脅迫下只有少數(shù)幾個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，而鉛離子脅迫下，則沒有明顯的上調(diào)。表明硫酸鹽同化基因?qū)τ阪k離子的抗性的較大，而對(duì)其他兩種金屬離子則較小。
　　 ④浸礦微生物重金屬抗性關(guān)鍵基因的過表達(dá)分析
　　 研究發(fā)現(xiàn)，CysE和CmtR基因是

12、轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的關(guān)鍵的抗性基因，為了進(jìn)一步的了解其功能，采用過表達(dá)分析的方法考查了其轉(zhuǎn)入受體菌之后的抗性的變化。結(jié)果表明:在不同濃度Cd2+的脅迫下，BL21導(dǎo)入重金屬抗性基因后，相對(duì)于對(duì)照組，菌體的生物量，沒有明顯的變化，但是其體內(nèi)Cys和GSH的含量卻有所增加，同時(shí)體內(nèi)的重金屬含量也是有所增加，說明導(dǎo)入抗性基因后其重金屬的抗性明顯增強(qiáng);不同濃度Zn2+的脅迫下，BL21導(dǎo)入重金屬抗性基因后，其相應(yīng)的結(jié)果與Cd2+相似，說明導(dǎo)入抗性基因

13、后其重金屬抗性增強(qiáng);不同濃度pb2+的作用下，BL21導(dǎo)入重金屬抗性基因后，無論是菌體的生物量、Cys和GSH的含量，還是其體內(nèi)的重金屬含量，相對(duì)于對(duì)照組均是降低的，說明導(dǎo)入抗性基因后其重金屬抗性沒有明顯的改善或者是下降的。
　　 ⑤重金屬浸出及其種群優(yōu)勢(shì)度的分析
　　 16S rDNA-RFLP分析結(jié)果表明，所選取的三個(gè)AMD(酸性礦坑水)采樣點(diǎn)中，均含有Acidithiobacillus菌屬的微生物，每個(gè)樣點(diǎn)均有部分

14、菌株獨(dú)立于已知菌株存在，獨(dú)立存在的菌株數(shù)目占所考查菌株數(shù)目的一半左右;并且三個(gè)樣點(diǎn)之間浸礦微生物的種類及數(shù)量相似度較大，說明這三個(gè)考查點(diǎn)其中的地球化學(xué)環(huán)境相似。用AMD對(duì)四種不同組成的礦石浸出后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)Ag、 Pb及Cu有一定的浸出能力，而對(duì)As和Pb幾乎沒有浸出效果。微生物群落分析得出:H71和F11群落結(jié)構(gòu)差異較大，而J72和S71幾乎一樣。從系統(tǒng)發(fā)育分析可知，所考查的序列可分為兩大分支:Acidithiobacillus菌屬和相