鎘抗性細(xì)菌Cupriavidus campinensis KQ46的分離鑒定及其鎘抗性機制研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟發(fā)展，重金屬鎘污染的問題日益嚴(yán)重，不斷威脅著生態(tài)環(huán)境和人類健康。微生物在鎘污染修復(fù)和治理中具有巨大的應(yīng)用價值，而微生物鎘抗性的高低是其應(yīng)用范圍的一個決定性因素，研究微生物的鎘抗性機制可以為微生物更好應(yīng)用于鎘污染治理與修復(fù)提供理論支持。
　　從南京市棲霞山鉛鋅礦區(qū)的鎘污染土壤及其附近生長的鎘超富集植物龍葵中共分離到72株鎘抗性細(xì)菌，其中34株分離自土壤，20株分離自龍葵根部，18株分離自龍葵莖。測定了菌株對鎘的最大耐受濃度(

2、MTC)和抗生素抗性，并對菌株的16SrDNA序列進行了測定和比對，發(fā)現(xiàn)菌株KQ46可以耐受的Cd2+濃度為4mM，對卡那霉素和慶大霉素敏感，確定以菌株KQ46為尋找鎘抗性相關(guān)基因的出發(fā)菌株。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實驗，初步鑒定KQ46為Cupriaviduscampinensis。
　　以KQ46為供試菌株，利用mini-mariner轉(zhuǎn)座子對其進行了隨機插入突變，從5000個突變子中篩選到10株可以穩(wěn)定生長且鎘抗性能力降低突

3、變株，鎘耐受濃度分別由4mM降低到0.8-1.0mM。利用SEFAPCR方法擴增了每個突變株中轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，通過同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)有6株突變株的轉(zhuǎn)座子插入的基因分別與aroG、ppd、alkK、ppc、細(xì)胞色素c533合成基因以及Acyl-CoA轉(zhuǎn)移酶基因高度同源，這6個基因均為基礎(chǔ)生長代謝所需要的基因;其余4株突變株中轉(zhuǎn)座子插入失活的基因分別可能為:hmp，與細(xì)胞抗逆性反應(yīng)相關(guān);hmyF，為重金屬離子外排的輔助蛋白;組氨酸激酶基

4、因，與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān);fcuA，鐵色素-鐵離子復(fù)合物的受體蛋白。
　　參考前人的研究結(jié)果后，認(rèn)為fcuA可能與胞內(nèi)Cd2+濃度調(diào)節(jié)有關(guān)，通過sau3AI隨機酶切建庫的方法獲得了KQ46中fcuA基因的全序列(GenBankAccessionNo.KC776916)及其部分側(cè)翼序列，構(gòu)建了MT21的fcuA基因回補菌株DRfcuA。通過測定培養(yǎng)過程中菌株KQ46胞內(nèi)Cd2+含量和培養(yǎng)基中Cd2+濃度并結(jié)合紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)和胞

5、外Cd2+濃度在培養(yǎng)過程中基本維持恒定，培養(yǎng)12h和24h胞內(nèi)鎘含量分別為0.548±0.016mg/g和0.552+0.008mg/g，進入衰亡期后細(xì)胞對Cd2+吸收增多，含量為1.038+0.046mg/g，而紅外光譜分析顯示細(xì)胞表面并沒有明顯吸附有Cd2+，由此認(rèn)為菌株KQ46主要依靠外排Cd2+來維持胞內(nèi)Cd2+含量處于可耐受范圍，從而產(chǎn)生鎘抗性。同時對MT21和DRfcuA研究后發(fā)現(xiàn)雖然MT21和DRfcuA對鎘的最大耐受濃度

6、均為0.8mM，但在含有0.5mMCd2+的培養(yǎng)條件下從掃描電鏡照片可以看出0.5mMCd2+對MT21毒害作用比DRfcuA明顯，DRfcuA吸收的Cd2+僅為MT21的50％左右，不過仍然顯著高于KQ46的吸收量，同時紅外光譜分析顯示在含有0.5mMCd2+的培養(yǎng)條件下MT21和DRfcuA的細(xì)胞在1735cm-1處具有紅外吸收峰，推測可能為細(xì)胞表面的酮、醛、酯類中的C=O鍵與Cd2+結(jié)合所致。由此分析認(rèn)為fcuA基因在Cupria