基于咔唑和三苯胺的熒光探針的合成及應(yīng)用.pdf

1、最近幾年，采用兩個(gè)低能量光子作為激發(fā)光源的雙光子熒光顯微鏡在成像厚的、不透明以及活生物樣本時(shí)比傳統(tǒng)的激光共聚焦顯微鏡更有優(yōu)勢(shì)。雙光子顯微鏡檢測(cè)靈敏度高，沒有圖像失真，低光漂白并且能減少光損傷。正是由于雙光子顯微鏡有上述優(yōu)點(diǎn)，使得生物學(xué)家得以在活細(xì)胞和活組織中觀察和研究生命過程。熒光顯微技術(shù)與熒光探針是相輔相成、相互促進(jìn)的，新的熒光顯微技術(shù)需要新的熒光探針，新的熒光探針促進(jìn)顯微技術(shù)發(fā)展。隨著雙光子顯微鏡的發(fā)展雙光子熒光探針得到不斷發(fā)展，但

2、是缺乏專用的具有大的吸收截面的雙光子探針限制了雙光子熒光顯微鏡的使用，因此開發(fā)新型的雙光子熒光探針具有重要意義。
　　細(xì)胞內(nèi)pH在細(xì)胞內(nèi)許多生理過程中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及自我吞噬。細(xì)胞內(nèi)pH值的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致細(xì)胞器功能障礙，許多疾病與此相關(guān)，如癌癥、中風(fēng)、阿耳茨海默氏疾病。因此，成像和定量測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)的pH值對(duì)于理解細(xì)胞生理功能機(jī)理是至關(guān)重要的。目前，熒光成像技術(shù)

3、研究細(xì)胞內(nèi)的pH值相對(duì)于微電極、核磁共振波譜以及光學(xué)顯微鏡等方法來說，是一個(gè)簡(jiǎn)單、靈敏、功能強(qiáng)大的工具。然而，僅僅是測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化（“熒光開”和“熒光關(guān)”），往往會(huì)受到光漂白、探針濃度、細(xì)胞中探針分布不均勻、不同細(xì)胞類型、細(xì)胞厚度變化、光穩(wěn)定性、激發(fā)光路長(zhǎng)度以及其他環(huán)境因素的影響。比例熒光成像由于利用同一發(fā)射光譜的兩個(gè)不同的熒光峰做比例，可以消除大部分外部因素的影響，從而實(shí)現(xiàn)自校準(zhǔn)，因此比例熒光探針可以用于復(fù)雜體系檢測(cè)pH值變化。<

4、br>　　1、本文設(shè)計(jì)合成了一種具有高選擇性、高膜透性、低毒性、高生物相容性能夠用于活細(xì)胞和活組織成像并能定量測(cè)量活細(xì)胞pH值的單/雙光子熒光探針。通過Heck反應(yīng)制備了基于咔唑衍生物有機(jī)小分子單/雙光子pH比例熒光探針(PCBT)，并通過核磁共振、高分辨質(zhì)譜確定其分子結(jié)構(gòu)。首先通過研究PCBT在不同極性溶劑中的熒光光譜變化，確定其熒光發(fā)射是ICT過程，這種熒光發(fā)射過程的分子適合作為比例熒光探針。其次，通過研究在酸堿條件下的線性吸收和熒

5、光發(fā)射的變化，確定PCBT對(duì)于pH值的變化有響應(yīng)，通過pH滴定實(shí)驗(yàn)，在體外驗(yàn)證了PCBT適合作為單/雙光子pH比例熒光探針。再次，由于氮原子容易與眾多金屬離子和陰離子結(jié)合，因此我們研究了PCBT對(duì)于一些細(xì)胞中常見的陰/陽離子的選擇性，證明PCBT對(duì)于其他離子響應(yīng)很少，對(duì)于H+有非常高的選擇性。
　　通過細(xì)胞毒性研究表明PCBT對(duì)于SiHa細(xì)胞具有低毒性，高生物相容性的特點(diǎn)。利用單/雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)PCBT染色的SiHa

6、和HeLa細(xì)胞，表明PCBT可以用于細(xì)胞單/雙光子顯微成像。DIC圖像證明細(xì)胞具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，貼壁生長(zhǎng)，活性良好。通過研究來自于不同光學(xué)窗口的熒光圖像的比例，證明PCBT可以在單/雙光子激發(fā)下對(duì)細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的pH值比例成像。利用細(xì)胞內(nèi)外pH值平衡以后的細(xì)胞通過顯微熒光成像得到不同pH值細(xì)胞的比例熒光圖像，將這些圖像與正常細(xì)胞比例熒光圖像的偽色彩做對(duì)比，可以定量測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH值。最后研究了活組織染色濃度、染色時(shí)間對(duì)于雙光子熒光成像深

7、度的影響。實(shí)驗(yàn)證明PCBT用于肝臟和腎臟活組織切片雙光子熒光顯微成像深度可以達(dá)到66μm和42μm，經(jīng)過歸納總結(jié)得出PCBT用于活組織成像最低濃度不能低于20μM染色時(shí)間最好是120分鐘以上，提高染色濃度能顯著提高成像深度。
　　2、設(shè)計(jì)、合成了三苯胺和咔唑衍生物(APPI、ECPI)用于定位細(xì)胞中的線粒體，通過研究其在不同極性溶劑中的熒光光譜變化，確定其熒光發(fā)射是PET過程。研究?jī)蓚€(gè)分子在酸堿條件下的發(fā)射光譜排除了兩個(gè)分子對(duì)pH

8、值的變化有響應(yīng)。通過MTT實(shí)驗(yàn)研究表明其對(duì)于SiHa細(xì)胞具有低毒性，高生物相容性的特點(diǎn)。利用單光子激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)APPI、ECPI染色的SiHa細(xì)胞，得到清晰艷麗的活細(xì)胞顯微熒光圖像。利用MTR和APPI、ECPI復(fù)染活SiHa細(xì)胞，通過計(jì)算得到APPI、ECPI和MTR共定位系數(shù)高達(dá)0.989、0.995，重合系數(shù)高達(dá)0.92和0.81，證明APPI、ECPI就是線粒體探針。
　　3、設(shè)計(jì)合成了基于咔唑和吡啶衍生物的熒光

9、染料，研究其在不同pH值緩沖溶液中的光物理性質(zhì)。通過MTT實(shí)驗(yàn)證明這些分子對(duì)于細(xì)胞具有低毒性高生物相容性的特點(diǎn)。通過活細(xì)胞成像試驗(yàn)說明這些咔唑和三苯胺衍生物均可用于活細(xì)胞成像，由于ECP和CP兩個(gè)分子本身具有雙熒光發(fā)射，用其來自于不同通道的熒光做了比例成像，結(jié)果顯示這兩個(gè)分子能夠在活細(xì)胞中比例成像，其偽色彩可以成像細(xì)胞質(zhì)中的不同位置，結(jié)合分子結(jié)構(gòu)，推測(cè)可能與細(xì)胞中氫離子分布有關(guān)。這些研究為以后利用咔唑和三苯胺衍生物設(shè)計(jì)活細(xì)胞熒光探針打下