制備具有生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度的半月板組織工程支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、因?yàn)榘朐掳褰M織解剖結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性,所以半月板的損傷是很常見(jiàn)的骨科疾病,而通過(guò)外科手術(shù)技術(shù)很少能真正地重建半月板組織。半月板是纖維軟骨組織,由納米級(jí)膠原纖維交錯(cuò)相連構(gòu)成半月板結(jié)構(gòu)的基本框架,從微觀上觀察,它又分為三層不同結(jié)構(gòu),構(gòu)成每一層結(jié)構(gòu)的膠原纖維有各自排列模式。半月板損傷后,無(wú)血液供應(yīng)部分不能再生,所以研究人員嘗試?yán)媒M織工程技術(shù)來(lái)重建半月板。
　　從目前國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn),尚無(wú)一種單一材料和單一的制備技術(shù)能制備出具備半月板纖維軟骨

2、組織特征的組織工程支架。應(yīng)用復(fù)合材料的原理和方法,將具有互補(bǔ)特性的兩種或兩種以上材料按一定比例和方式組合,制成兼?zhèn)錂C(jī)械強(qiáng)度、可降解性和生物相容性的復(fù)合材料,并選擇適宜的制備工藝,可以設(shè)計(jì)構(gòu)造出能夠滿足組織工程支架所需的結(jié)構(gòu)和性能優(yōu)化的三維復(fù)合材料支架。目前復(fù)合材料種類繁多,而天然生物材料與人工合成高分子材料之間的復(fù)合,顯現(xiàn)了良好的組織相容性及生物力學(xué)特性,適合應(yīng)用在半月板這種組織構(gòu)造比較特殊的軟骨組織重建。在本課題中,根據(jù)人工合成材料聚

3、乳酸(PLA)具備一定的機(jī)械強(qiáng)度,又有彈性,符合半月板的“雙相”特性,我們選用其作為生物材料中的基本成分,為了增加它的可降解性,將它與聚羥基乙酸(PGA)復(fù)合,為了改善它的生物相容性,我們又利用天然生物聚合物明膠對(duì)它進(jìn)行表面修飾。同時(shí),考慮到組織工程支架的形貌結(jié)構(gòu)對(duì)引導(dǎo)細(xì)胞增殖方向,誘導(dǎo)組織形成起到關(guān)鍵作用,設(shè)計(jì)制備的支架就要很好地仿生組織的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。靜電紡絲技術(shù)能夠制備納米級(jí)的纖維結(jié)構(gòu)支架,很好地仿生了細(xì)胞外基質(zhì)的膠原纖維結(jié)構(gòu)。

4、根據(jù)前期工作,改變接收板材質(zhì)為銅質(zhì),增加一個(gè)電場(chǎng),先行應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備聚乳酸聚羥基乙酸(PLGA)纖維結(jié)構(gòu)的支架作為支架基底層,仿生半月板組織的細(xì)胞外基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu),再在PLGA纖維結(jié)構(gòu)支架表面紡一層明膠纖維結(jié)構(gòu)支架對(duì)PLGA進(jìn)行表面修飾,制成雙層結(jié)構(gòu)支架,增加PLGA支架的親水性和組織相容性。制備的支架兼具機(jī)械強(qiáng)度、可降解性和組織相容性。
　　鑒于靜電紡絲技術(shù)制備的支架達(dá)到一定厚度后,因高分子材料的絕緣性和電場(chǎng)力的限制,再想提

5、高支架的厚度,有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。而熱致相分離(TIPS)技術(shù),使三維立體結(jié)構(gòu)支架的厚度得到大大地改觀,改良的梯度熱致相分離技術(shù),又使支架孔隙的排列走向得到控制。我們選用有韌性可降解材料聚3-羥基丁酸酯共聚4-羥基丁酸酯poly(3-hydroxybutyrateo-co-4-hydroxybutyrate),簡(jiǎn)稱P(3HB-co-4HB),復(fù)合聚乳酸(PLA),改善PLA的降解性,利用梯度熱致相分離技術(shù)制備PLA/P(3HB-co-4HB

6、)取向孔隙三維支架,再結(jié)合物理吸附作用,將天然生物聚合物明膠涂覆在支架表面,更加改善了支架的生物相容性,使其具備誘導(dǎo)細(xì)胞取向增殖,促進(jìn)組織形成,發(fā)揮組織工程支架的作用。
　　第一部分 靜電紡絲技術(shù)制備有機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞相容性的雙層納米纖維結(jié)構(gòu)半月板組織工程支架
　　目的:1.利用靜電紡絲技術(shù)制備組織工程支架。2.通過(guò)明膠纖維的表面修飾提高支架生物相容性。3.評(píng)估支架具備適合組織工程支架要求的物理化學(xué)性質(zhì)。
　　方法:在前

7、期工作基礎(chǔ)上,改進(jìn)靜電紡絲設(shè)備,將接收板改用銅質(zhì)材料,并在接收板上增加一個(gè)新的電場(chǎng),利用“層-層沉積”技術(shù),先紡出一層PLGA纖維結(jié)構(gòu)支架作基底層,再紡制一層明膠(Gelatin)纖維結(jié)構(gòu)在其表面上沉積制備雙層結(jié)構(gòu)支架。同時(shí)以純的PLGA和明膠混合PLGA分別各紡出一種纖維支架作為對(duì)照組。將三種支架的表征、親水性、降解性和機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試比較。
　　結(jié)果:Gelatin/PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架與另外兩種支架對(duì)比,具備直徑合適的納

8、米級(jí)纖維、有較大孔徑、較高的孔隙率、較高的親水性、滿意的降解率和良好的機(jī)械強(qiáng)度。
　　結(jié)論:明膠/PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架仿生了半月板組織細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu),具備作為組織工程支架的理化特性。
　　第二部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的半月板細(xì)胞種植支架聯(lián)合培養(yǎng)
　　目的:1.提取兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行誘導(dǎo)分化為半月板細(xì)胞。2.將細(xì)胞種植于前面制備的三種不同的纖維結(jié)構(gòu)支架上,在體外進(jìn)行培養(yǎng)。3.觀察細(xì)胞在支架上的形態(tài),通過(guò)

9、細(xì)胞增殖情況及合成分泌功能的比較分析,評(píng)估不同支架的細(xì)胞相容性。
　　方法:應(yīng)用密度梯度離心法提取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng),獲得的纖維軟骨細(xì)胞通過(guò)表征觀察和特異性染色(H.E、甲苯胺藍(lán)、AB-PAS、Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色)進(jìn)行鑒定。接種細(xì)胞于三種不同支架,通過(guò)觀察細(xì)胞表征、組織染色、增殖測(cè)試評(píng)估三種不同支架對(duì)細(xì)胞的相容性及對(duì)細(xì)胞特性的保持。
　　結(jié)果:提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化成半月板纖維軟骨細(xì)

10、胞,種植于支架后能夠增殖,并保持纖維軟骨細(xì)胞的表征和功能,尤其在明膠/PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架上增殖顯著。
　　結(jié)論:明膠/PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架接種經(jīng)誘導(dǎo)分化的纖維軟骨細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)為組織工程技術(shù)重建半月板提供理論依據(jù)。
　　第三部分 制備具有生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度的Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)三維組織工程支架
　　目的:1.改進(jìn)的梯度熱致相分離技術(shù)制備PLA/P(3HB-co-4HB)三維多孔

11、取向支架。2.在支架表面吸附明膠(Gelatin)進(jìn)行修飾,制備的支架進(jìn)行表征、親水性、降解性和機(jī)械強(qiáng)度的測(cè)試評(píng)估。3.支架上種植前面獲得的誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,評(píng)估支架的細(xì)胞相容性。4.與第一部分制備的Gelatin/PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞相容性方面的對(duì)比。
　　方法:應(yīng)用改進(jìn)的梯度熱致相分離技術(shù)制備PLA/P(3HB-co-4HB)三維多孔支架,用物理吸附方法以明膠對(duì)支架進(jìn)行表面修飾,標(biāo)記為Gelat

12、in/PLA/P(3HB-co-4HB)支架,制備的支架與未經(jīng)過(guò)修飾的PLA/P(3HB-co-4HB)支架進(jìn)行表征、孔隙率、降解性、親水性和機(jī)械力學(xué)性能的測(cè)試對(duì)比后,種植經(jīng)誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過(guò)觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng),及細(xì)胞一支架復(fù)合體的特異性染色和掃描電鏡、共聚焦顯微鏡觀察情況進(jìn)行對(duì)比分析,評(píng)估明膠修飾支架在細(xì)胞相容性方面的優(yōu)越性。為了選擇更優(yōu)越的支架,再與第一部分制備的Gelatin/PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架進(jìn)行拉伸強(qiáng)度

13、和細(xì)胞種植支架增殖情況的對(duì)比。
　　結(jié)果:梯度熱致相分離技術(shù)制備的三維多孔支架經(jīng)明膠修飾后,具備較理想的理化性質(zhì),種植其上的經(jīng)誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠很好地增殖,并保持纖維軟骨表征。與Gelatin/PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架對(duì)比,有更強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度和優(yōu)越的細(xì)胞相容性。
　　結(jié)論:相比Gelatin/PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架,明膠修飾的PLA/P(3HB-co-4HB)三維立體結(jié)構(gòu)支架更適于成為半月板組織工程支架。

14、　　第四部分 Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)支架負(fù)載誘導(dǎo)分化的干細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)構(gòu)建纖維軟骨的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:檢測(cè)細(xì)胞一支架復(fù)合體植入裸鼠皮下構(gòu)建纖維軟骨組織。
　　方法:首先測(cè)試支架的安全性,用支架浸提液進(jìn)行皮下刺激試驗(yàn)和急性毒性實(shí)驗(yàn)。然后將前面實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到的經(jīng)示蹤劑染色的誘導(dǎo)分化干細(xì)胞負(fù)載于支架上構(gòu)成復(fù)合體與單純無(wú)細(xì)胞支架植入裸鼠皮下,進(jìn)行培養(yǎng)4周后,在多功能活體成像系統(tǒng)下觀察,確認(rèn)支架內(nèi)細(xì)胞存

15、活、增殖。將裸鼠處死,取出細(xì)胞一支架復(fù)合體,制成切片,進(jìn)行組織染色和免疫組化染色觀察對(duì)比。
　　結(jié)果:制備的Gelatin/PLA/P(3 HB-co-4HB)支架是有生物相容性的,是安全的。負(fù)載誘導(dǎo)分化干細(xì)胞的支架植入裸鼠皮下后,可見(jiàn)支架內(nèi)被標(biāo)記的細(xì)胞增殖明顯,細(xì)胞融合,相互聯(lián)系,分泌纖維軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。在支架環(huán)境中,有半月板纖維軟骨組織形成的趨勢(shì)。
　　結(jié)論:負(fù)載誘導(dǎo)分化干細(xì)胞的Gelatin/PLA/P(3 HB-co