利用纖維素生物質原料生產燃料乙醇的關鍵技術研究.pdf

1、隨著社會經濟的不斷發(fā)展和人口的增長,人類對能源的需求與日俱增,燃料乙醇作為一種清潔的可再生能源成為關注熱點。利用豐富而廉價的纖維素資源代替糧食淀粉生產燃料乙醇對社會的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。但纖維素酶解效率低、纖維素無法被充分利用等問題成為纖維素乙醇生產大規(guī)模發(fā)展的障礙。本論文針對上述現狀,從構建同時糖化發(fā)酵的重組菌和構建利用木糖、葡萄糖共發(fā)酵的重組釀酒酵母出發(fā),進行了以下研究:
　　 利用酵母表面展示技術,將纖維素酶在釀酒酵母

2、表面固化表達,構建可以利用纖維素原料進行發(fā)酵生產乙醇的重組釀酒酵母。將克隆自短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)C-9的內切纖維素酶(EGX)與α-凝集素小亞基編碼蛋白Aga2p融合,連接入酵母整合載體Ylp5,為實現纖維素酶在釀酒酵母中高效、穩(wěn)定的表達,將融合蛋白置于酵母強啟動子PGK的控制之下,同時,將融合蛋白整合入釀酒酵母染色體rDNA區(qū)域,大大提高外源基因在宿主細胞中的拷貝數。免疫熒光、免疫點雜交及酶活分析結果表明:

3、EGX已成功在釀酒酵母表面表達;將重組釀酒酵母在以羧甲基纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,結果表明:重組菌可以利用纖維素碳源并生成乙醇,經過55 h的發(fā)酵,乙醇產量可達3.92 g·L-1;由于整合入酵母染色體中,外源基因在宿主細胞中的穩(wěn)定性增加,即使連續(xù)培養(yǎng)60世代egX基因仍可穩(wěn)定存在于宿主細胞中。
　　 木糖是纖維素水解液中含量僅次于葡萄糖的一種單糖,它的充分利用是提高纖維素原料利用率的關鍵。傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵菌株釀酒酵母不

4、能利用木糖,但可利用其異構體形式-木酮糖。在釀酒酵母中引入木糖還原酶基因(xyl1)和木糖醇脫氫酶基因(xyl2),可開辟木糖代謝途徑,構建可利用木糖進行發(fā)酵生產乙醇的重組菌株。但由于兩種酶所需輔酶不同,常導致重組細胞內氧化還原失衡,造成中間產物的積累。本文利用定點突變技術,對來自樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的木糖醇脫氫酶(PsXDH)進行突變,在一定程度上改變了其輔酶特異性。
　　 為構建可利用木糖的重組酵母

5、,將樹干畢赤酵母木糖異構酶、木糖醇脫氫酶(突變體)及釀酒酵母內源木酮糖激酶分別置于PGK啟動子之下,構建了rDNA介導的多拷貝整合和URA3介導的單拷貝整合的重組質粒,并轉化到釀酒酵母W303-1A中,得到重組酵母SXYL123-rDNA,SXYL123-rDNA,SXYL123和SMXYL123。熒光定量PCR分析結果表明:與URA3介導的單拷貝整合相比,rDNA介導的多拷貝整合載體使外源基因的拷貝數提高了16倍;沉默信息調節(jié)因子Si

6、r2p對rDNA區(qū)域的同源重組具有抑制作用,利用Cre/LoxP系統(tǒng)將釀酒酵母中sir2基因的編碼區(qū)敲除掉,然后將rDNA介導的多拷貝整合質粒轉化入sir2基因敲除的釀酒酵母中,構建重組菌△SMXYL123-rDNA。結果表明,sir2基因的敲除使rDNA區(qū)域的整合率提高了4倍。將重組菌進行葡萄糖和木糖共發(fā)酵實驗,結果表明:與對照菌株相比,重組菌的木糖利用能力及乙醇產率均有所提高,木糖醇脫氫酶的突變減少了中間產物木糖醇的積累;其中重組菌