聚碳酸亞丙酯-殼聚糖微球復合電紡絲載藥系統(tǒng)在脊髓損傷修復中的應用研究.pdf

1、脊髓損傷(SCI)后的再生修復和功能重建一直是醫(yī)學界難以解決的問題。SCI在大多數(shù)國家的年發(fā)病率為20-40/100萬，在我國隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和交通運輸效率的不斷提高而呈逐年上升趨勢。SCI后致殘率高，常常導致截癱等嚴重功能障礙，給患者及其家庭和社會帶來極其沉重的經(jīng)濟和社會負擔。
　　一直以來，人們認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)沒有再生能力，自從Richardson在《Nature》上發(fā)表論文，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生能力才被人們逐漸認知

2、。近年來的實驗結果表明，CNS的再生修復能力與細胞的類型、發(fā)育程度以及細胞與損傷位置的距離有關，也與損傷后髓磷脂降解產(chǎn)生廢物，離子穩(wěn)態(tài)破壞，神經(jīng)遞質釋放改變，遞質受體功能障礙以及免疫炎性反應有關。
　　同時，脊髓損傷往往會改變脊髓復雜的解剖結構，損害脊髓正常生理功能，所以損傷后恢復相應的解剖結構是功能恢復的必要前提。組織工程材料以其良好的力學性能及可塑性等優(yōu)點逐漸成為脊髓損傷后再生修復的一個可能方向。眾多研究表明，生物材料作為神經(jīng)

3、干細胞的載體，既可以承載神經(jīng)營養(yǎng)因子等細胞因子，又可以為損傷后的脊髓提供力學支撐，減少創(chuàng)傷區(qū)域的瘢痕形成。理想的生物材料應具有良好的組織相容性，并且較少或完全不會引起其他不良反應;具有優(yōu)秀的可塑造性及力學特性，以便于加工成為各種目標形態(tài);若想承載細胞，需有良好的界面使細胞便于粘附生長;還應有穩(wěn)定的或可調(diào)節(jié)的降解速率，以便適應不同細胞、營養(yǎng)因子發(fā)揮作用的時間;并且降解產(chǎn)物應無毒副作用。常見的組織工程材料主要有:(1)天然可降解聚合物;(2

4、)人工合成可降解聚合物;(3)人工合成非可降解聚合物;(4)復合材料。這些材料的應用形式有支架、微球、電紡絲膜片、套管等。
　　脊髓損傷后可應用的藥物除了甲基強的松龍得到普遍的認可和使用外，其他藥物尚未獲得廣泛認可或者由于其他的限制因素無法實際應用。目前有多種藥物在實驗中顯示出了良好的效果，包括類固醇、阿片受體拮抗劑、抗脂質過氧化反應劑、神經(jīng)生長因子、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和硫酸軟骨素酶ABC(ChABC)等。
　　本文研究

5、探討了可降解高分子生物材料聚碳酸亞丙酯(PPC)電紡絲和殼聚糖微球復合材料緩釋載體的制作方法，以及其在脊髓損傷修復中應用的可行性，并研究了以該緩釋材料為載體局部緩釋不同藥物對脊髓損傷后軸突再生及功能重建的作用。
　　制作生物可降解載藥高分子材料
　　由于載藥緩釋材料良好的生物相容性，可降解性與持續(xù)釋放藥物等特點，其在脊髓損傷中的應用研究日漸增多。多數(shù)高分子可降解材料均在體內(nèi)降解為酸性物質，有可能為脊髓損傷部位帶來二次損傷，所

6、以本研究選用了PPC，其可在體內(nèi)最終降解為二氧化碳和水，且擁有很好的生物相容性;殼聚糖具有優(yōu)異的生物相容性及可降解性，可以溶于水，為荷載蛋白類藥物并保持其活性提供可靠保障。各緩釋材料制作簡述如下:
　　制備單獨載db-cAMP的PPC電紡絲:稱量過的PPC原料和db-cAMP粉末放入30mm×50mm的小燒杯中，加入乙腈，攪拌6小時，得到乳白色均勻溶液。溶液中db-cAMP與PPC的質量比為1∶9。利用靜電紡絲機進行紡絲，使用接地

7、的錫紙作為接收裝置，得到單獨載db-cAMP的電紡絲膜片。
　　制備含ChABC的殼聚糖微球:稱量過的殼聚糖(CS)粉末放入30mm×50mm的小燒杯中，加入1％乙酸水溶液，攪拌6小時，得到溶液A。準確稱量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末，配制1％的PVP水溶液，微熱攪拌3小時，放入4℃冰箱中，得到溶液B。取ChABC，加入上述PVP水溶液中，攪拌得到溶液C。將溶液C與溶液A混合，攪拌均勻后，得到溶液D。配置1％的多聚磷酸鈉水溶液，將

8、溶液D緩慢滴加到多聚磷酸鈉水溶液中，滴完攪拌3小時，得到乳狀渾濁液，將此渾濁液離心分離，離心力2000g，并用水洗兩次，沉淀凍干，獲得含有ChABC的CS微球。
　　制備含有ChABC的電紡絲-微球和含有ChABC與db-cAMP的電紡絲-微球膜片:將得到的含有ChABC的CS微球定量加入二氯甲烷中，進行超聲分散10分鐘，然后加入PPC原料和db-cAMP粉末，攪拌至固體全部溶解，得到乳白色溶液。利用靜電紡絲設備進行紡絲，使用接地

9、的平整錫箔紙作為接收裝置。噴頭至錫箔紙距離為15cm，紡絲電壓為10kV。收集到載藥纖維，得到電紡絲-微球載藥纖維復合膜;前法中不加db-cAMP粉末即得到只含ChABC的電紡絲-微球膜片。
　　建立大鼠脊髓損傷模型
　　本實驗希望通過研究載藥緩釋材料在脊髓損傷中的應用，了解高分子緩釋材料在脊髓損傷治療中的應用可能性，并觀察損傷后軸突的再生情況，觀察再生軸突是否可以穿透膠質瘢痕。有鑒于此，我們選擇了便于觀察軸突再生的損傷模型

10、——大鼠脊髓半橫斷模型。造模過程簡述如下:
　　雌性Wister大鼠(200-230g)腹腔注射麻醉后固定于手術臺上，剃毛消毒后，充分暴露T7-T9脊椎棘突，咬除T8棘突，打開椎弓板，辨認后正中動脈，用11號刀垂直切入脊髓，半橫斷右側脊髓，確認止血后，根據(jù)分組不同，分別植入相應的載藥緩釋材料，逐層縫合。
　　術后給予20萬U/天青霉素，2ml腹腔注射，每日一次，連續(xù)三天，術后對大鼠進行腹部按摩，幫助其排尿，每日三次，直至其恢

11、復自主排尿。
　　單獨載db-cAMP電紡絲在大鼠脊髓半切模型中應用的可行性及其效果的研究
　　損傷模型造好之后，載藥材料植入橫斷損傷部位，縫合傷口，給予術后護理。在第1，2，3，4周各時間點采用BBB評分觀察評價大鼠后肢運動功能恢復情況，并取材。免疫熒光以及免疫組化染色觀察軸突再生、瘢痕形成、空洞形成等指標，用于評價各載藥材料對大鼠脊髓半切損傷后軸突再生以及功能恢復的作用。
　　單獨載db-cAMP的生物可降解材料P

12、PC電紡絲在大鼠脊髓半切損傷治療的應用中，PPC和db-cAMP的混合溶液，做成電紡絲膜片。然后在體外模擬體內(nèi)環(huán)境檢測db-cAMP的釋放數(shù)據(jù)，得到其釋放曲線。結果顯示，我們的電紡絲材料可以把db-cAMP的釋放時間延長至8天，并且釋放速度穩(wěn)定。在SCI后第1，2，3，4周各時間點應用BBB評分量表對大鼠運動功能進行評價，而后借助免疫熒光和免疫組化技術對損傷區(qū)域的軸突再生和瘢痕形成進行研究。BBB結果顯示植入載藥電紡絲膜片組（實驗組）大

13、鼠功能恢復比對照組以及空白PPC組好，免疫組化和免疫熒光結果顯示實驗組大鼠有更多的軸突長入膠質瘢痕，軸突再生更活躍，并且損傷部位瘢痕更薄。實驗結果證明PPC載藥電紡絲膜片可以在大鼠脊髓損傷的治療中應用，為脊髓損傷的治療提供了一個新的給藥選擇。
　　聯(lián)合db-cAMP和ChABC材料與單獨用藥的效果比較研究
　　我們在PPC電紡絲載藥材料的基礎上，引入了CS微球，把蛋白類藥物ChABC和靜電紡絲聯(lián)合起來，拓寬了蛋白類藥物在脊髓

14、損傷治療中的應用渠道，也增加了脊髓損傷的治療手段。再次驗證了生物可降解高分子材料PPC電紡絲和殼聚糖微球載藥體系在脊髓損傷局部緩釋藥物的可行性。同時驗證了小分子化學藥物db-cAMP和大分子蛋白類藥物ChABC在脊髓損傷局部緩釋的作用。實驗證明，上述兩種單藥應用都各自具有一定效果，但促進軸突再生和功能恢復的作用并非十分顯著。考慮到脊髓損傷修復障礙由不同因素構成，因此本實驗進行藥物聯(lián)合應用，研究電紡絲-微球載藥系統(tǒng)同時荷載兩種藥物的可行性

15、，驗證其聯(lián)合應用時在脊髓損傷的再生修復方面有無協(xié)同作用，在緩釋方面有無相互影響，并分別和單獨給藥相比較。
　　檢測單獨載藥和聯(lián)合載藥材料中藥物的體外釋放曲線，結果顯示，與單獨載藥時相比較，聯(lián)合載藥時的藥物釋放曲線并無明顯差別。在損傷后1，2，3，4周各時間點用BBB評分法對大鼠運動功能進行評分，并應用免疫熒光和免疫組化觀察軸突再生和瘢痕形成。結果證實，各實驗組中軸突再生以及運動功能恢復均優(yōu)于對照組;載有ChABC的材料組，瘢痕壁不

16、連續(xù)，瘢痕疏松;單獨緩釋db-cAMP組和單獨ChABC組在功能恢復方面無顯著性差異;聯(lián)合用藥組的軸突再生以及運動功能恢復情況均好于單獨給藥組，組間BBB評分有顯著性差異(p≤0.05)。
　　本研究的主要結論:
　　1.可降解PPC電紡絲以及殼聚糖微球擁有很好的生物組織相容性以及局部緩釋藥物能力，并且可以通過調(diào)節(jié)電紡絲的直徑、拉伸率、斷裂伸長率和殼聚糖微球直徑等物理特性調(diào)整其降解速度以達到優(yōu)化藥物緩釋的目的。
　　2

17、.載有雙丁酰環(huán)磷酸腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate，db-cAMP)的PPC電紡絲材料可以促進大鼠SCI后軸突再生、運動功能恢復、減少膠質瘢痕形成。
　　3.載有硫酸軟骨素酶ABC(ChABC)的殼聚糖微球復合PPC電紡絲材料可以很好地緩釋ChABC，阻止空洞內(nèi)瘢痕壁形成，使軸突更容易通過損傷區(qū)域，促進大鼠脊髓損傷后運動功能恢復。
　　4.聯(lián)合載ChABC和db-cAMP

18、的電紡絲-微球材料與緩釋單一藥物材料相比進一步改善了SCI后大鼠的運動功能，使損傷區(qū)域殘存神經(jīng)纖維增多、膠質瘢痕與空洞接觸面變得不規(guī)則，瘢痕減少。
　　實驗結果表明，PPC電紡絲和殼聚糖微球復合材料緩釋載體可穩(wěn)定地在脊髓損傷局部釋放治療藥物，并且其降解和緩釋藥物的速度可調(diào)控。該復合材料可為神經(jīng)系統(tǒng)局部緩釋藥物治療提供良好的載體，并能為CNS損傷修復、抗腫瘤治療及退行性疾病等領域的研究提供新的研究平臺。本實驗結果顯示該復合材料緩釋載