動物細(xì)胞生物反應(yīng)器關(guān)鍵技術(shù)研究及其結(jié)構(gòu)優(yōu)化.pdf

1、牛頓力學(xué)統(tǒng)治了世界幾百年,未來生物技術(shù)將成為主導(dǎo)21世紀(jì)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵力量。生物反應(yīng)器是人類進(jìn)行生物目標(biāo)產(chǎn)品開發(fā)及生產(chǎn)的關(guān)鍵設(shè)備。我國在生物反應(yīng)器的開發(fā)研究中存在基礎(chǔ)理論研究投入少、細(xì)胞的剪切敏感性認(rèn)知不足、半經(jīng)驗方式設(shè)計、反應(yīng)器效能低下、仿制國外低端產(chǎn)品等問題。針對這些問題,本文從CHO細(xì)胞入手,CHO細(xì)胞即中國倉鼠卵巢細(xì)胞,是動物細(xì)胞工程產(chǎn)業(yè)應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞之一,首先對 CHO細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行了研究;以其力學(xué)特性為基礎(chǔ)分別對生

2、物反應(yīng)器的攪拌器、罐體結(jié)構(gòu)、溫度維持、供料位置進(jìn)行仿真優(yōu)化;氣泡分布器作為生物反應(yīng)器中的供氧裝置十分關(guān)鍵,但生成的氣泡直徑不好度量以及破裂過程中高速剪切損傷細(xì)胞,通過仿真及實驗方法使得這些問題得到很好的解決;本文提出一種新的方法——剪切率參量法,在未制造樣機(jī)的前提下,利用現(xiàn)有設(shè)備可以對新研制反應(yīng)器剪切環(huán)境進(jìn)行驗證評價,剪切率參量法驗證方法簡單可靠,縮短研發(fā)周期,節(jié)約成本。
　　為了給生物反應(yīng)器設(shè)計提供基礎(chǔ)性的依據(jù),借助原子力顯微鏡

3、,對 CHO細(xì)胞進(jìn)行成像及力學(xué)測量,測量得到生理狀態(tài) CHO細(xì)胞的彈性模量為5.278±0.395kPa,借助數(shù)值計算及細(xì)胞培養(yǎng)實驗分析 CHO細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的受力環(huán)境,得到 CHO細(xì)胞培養(yǎng)時能夠承受的合理的剪切力約為0.392Pa,此時流場剪切率為391.41(1/s),在此剪切應(yīng)力作用下對于20μm的細(xì)胞來說U方向的最大位移量大約為12.9μm。為反應(yīng)器的設(shè)計中解決流體剪切的問題提供依據(jù)。
　　規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器研發(fā)

4、主要需要解決兩個關(guān)鍵要素,首先是保證流場混合的均勻性,同時要解決好流場剪切力對細(xì)胞的影響,以 CHO細(xì)胞承受的合理剪切力為參考,在降低流場剪切作用以及滿足流場混合效果的前提下,優(yōu)化后的反應(yīng)器結(jié)構(gòu)采用45o葉片夾角的 Elephant Ear攪拌器,下吸式安裝,罐體高徑比為1、罐底半徑為罐體直徑的一半為、攪拌器安裝高度與罐體高度比為、擋板數(shù)量為3對,此優(yōu)化結(jié)構(gòu)流場效果最好。細(xì)胞培養(yǎng)過程中溫度需要嚴(yán)格控制,建立該反應(yīng)器的溫度場仿真模型,對三

5、種供熱保溫結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比仿真分析,表明當(dāng)采用整體壁面加熱時,反應(yīng)器內(nèi)的流體能較快的達(dá)到溫度均衡。反應(yīng)器供料位置對物料混合效果影響明顯,利用示蹤劑法,找到反應(yīng)器較優(yōu)的供料位置,縮短混合時間。
　　氣泡分布器作為反應(yīng)器的供氧裝置用于生成氣泡,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中氣泡在分布器孔口形成上升破裂主要與三個參量有關(guān),通過研究得到了一定范圍內(nèi)氣泡平均直徑大小與孔口通氣速度、表面張力系數(shù)和孔口直徑之間的關(guān)系式。定量角度分析了直徑在4mm-10mm范圍內(nèi)

6、變化的氣泡破裂過程中產(chǎn)生的在0.97-1.91Pa之間變化,根據(jù) CHO細(xì)胞的承受的最大剪切力為0.392Pa左右,可知在此范圍的氣泡破裂過程中均會造成細(xì)胞的損傷。而氣泡越小,氣液表面積比越大,這樣反應(yīng)器內(nèi)溶氧越好,為了滿足細(xì)胞培養(yǎng)過程中的溶氧需求,因此氣泡直徑控制在4mm左右為宜。氣泡分布器安裝時通氣孔離生物反應(yīng)器底部的距離對氣含率的影響不大,大分布環(huán)的使得氣含率更加均勻,而且大分布環(huán)通氣結(jié)構(gòu)能有效防止氣體直接由攪拌器區(qū)直接上升至液面

7、溢出,降低氣含率,所以實際應(yīng)用中可以根據(jù)需要應(yīng)盡量選用大分布環(huán)氣泡分布器。
　　生物反應(yīng)器設(shè)計制造中的需要解決的關(guān)鍵問題之一就是流場混合過程中產(chǎn)生的剪切力對細(xì)胞的損傷,反應(yīng)器研發(fā)初期很難對這一問題進(jìn)行度量驗證,一般通過制造樣機(jī)進(jìn)行實驗驗證,一種新的驗證方法剪切率參量法應(yīng)運(yùn)而生,它可以在現(xiàn)有實驗室設(shè)備的基礎(chǔ)上通過實驗和仿真方法,使得這一問題得到解決。針對本論文提出的多項技術(shù),設(shè)計了反應(yīng)器實驗系統(tǒng),利用該實驗系統(tǒng)驗證了本文提出的剪切率

8、參量法,當(dāng)采用上通氣的情況下,轉(zhuǎn)速為180r/min時,細(xì)胞密度增量最大,其主流場區(qū)域平均剪切率為14.5,符合本文提出的剪切率參量法的適宜細(xì)胞生長的平均剪切率范圍11.6～17.4(1/s);實驗系統(tǒng)包括攪拌器、罐體結(jié)構(gòu)、加熱保溫裝置、氣泡分布器均采用本文的優(yōu)化結(jié)果,在此結(jié)構(gòu)參數(shù)下采用上通氣轉(zhuǎn)速在180r/min時可以獲得較好的培養(yǎng)效果,當(dāng)采用下通氣轉(zhuǎn)速為80r/min時氣泡直徑為在4～8mm范圍獲得較好的培養(yǎng)效果,其性能與美國NBS