利用秸稈水解液的微生物暗發(fā)酵產(chǎn)氫特性及機(jī)制研究.pdf

1、秸稈類木質(zhì)纖維素以其數(shù)量大、價(jià)格低廉、可再生、獲取容易等諸多優(yōu)點(diǎn)成為暗發(fā)酵生物制氫潛在的適宜底物。利用秸稈類物質(zhì)進(jìn)行生物制氫可以大大降低氫氣的生產(chǎn)成本,使生物制氫在經(jīng)濟(jì)上更具有可行性,同時(shí)避免了秸稈類物質(zhì)通常的焚燒處理導(dǎo)致的嚴(yán)重環(huán)境污染。然而,秸稈類物質(zhì)具有高結(jié)晶度、高異質(zhì)性的復(fù)雜結(jié)構(gòu),致使微生物對(duì)其的直接降解效率較低。因此,利用富含戊糖、己糖的秸稈水解液進(jìn)行微生物發(fā)酵產(chǎn)氫成為生物制氫產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要發(fā)展方向。目前,在混合微生物進(jìn)行秸稈

2、水解液發(fā)酵產(chǎn)氫過程中,存在著底物降解不充分,產(chǎn)氫效率較低等瓶頸問題,嚴(yán)重阻礙了秸稈水解液產(chǎn)氫的生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用。另一方面,對(duì)秸稈水解液利用過程中的微生物產(chǎn)氫分子機(jī)制亦不清楚,難以從理論層面指導(dǎo)實(shí)際產(chǎn)氫工藝的運(yùn)行過程。
　　基于此,本研究考察了種泥預(yù)處理和發(fā)酵溫度對(duì)不同類型混合微生物利用秸稈水解液產(chǎn)氫過程的影響。為提高系統(tǒng)的底物降解率與產(chǎn)氫能力,采用對(duì)秸稈水解液具有高效降解、產(chǎn)氫能力的菌株Thermoanaerobacterium th

3、ermosaccharolyticum W16對(duì)混合微生物利用秸稈水解液產(chǎn)氫過程進(jìn)行了生物強(qiáng)化。通過擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和木質(zhì)纖維素降解基因分析闡述了T.thermosaccharolyticum類型微生物在秸稈類物質(zhì)利用過程中的分子機(jī)制。對(duì)菌株W16的[FeFe]-氫化酶基因簇進(jìn)行了基因克隆、特征分析與轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析,解析了T.thermosaccharolyticum類型微生物的產(chǎn)氫機(jī)制。
　　結(jié)果表明,熱、酸、堿、超

4、聲和紫外五種預(yù)處理方法中,熱預(yù)處理對(duì)活性污泥、河流底泥和顆粒污泥中混合微生物的產(chǎn)氫過程具有較好提升效果,熱預(yù)處理下的活性污泥接種達(dá)到了最大的氫氣產(chǎn)量5.03mmol/g-sugar utilized。在不同發(fā)酵溫度(30°C、37°C、55°C、70°C)中,55°C時(shí)三種類型種泥均達(dá)到最高氫氣產(chǎn)量,顆粒污泥接種時(shí)數(shù)值最大(7.74mmol/g-sugar utilized),而70°C時(shí)混合微生物對(duì)秸稈水解液的產(chǎn)氫效能顯著低于55°C

5、。預(yù)處理過程和高溫條件顯著改變了微生物群落結(jié)構(gòu),使之由Enterobacter spp.、Escherichia spp.、Klebsiella spp.等兼性微生物的普遍存在,轉(zhuǎn)變?yōu)镃lostridium spp.、Bacillus spp.、Thermoanaerobacterium spp.等高效厭氧產(chǎn)氫微生物的大量富集。
　　菌株W16的生物強(qiáng)化作用可以顯著提升腐爛秸稈和厭氧污泥接種時(shí)混合微生物利用秸稈水解液過程的氫氣產(chǎn)量

6、,同時(shí)一定程度提高了底物降解率,生物強(qiáng)化下的腐爛秸稈接種達(dá)到最高的氫氣產(chǎn)量9.90mmol-H2/g-sugar utilized。AFLP分析顯示T.thermosaccharolyticum類型微生物具有較高的基因組DNA保守性,差異條帶中的2-polyprenylphenol 6-hydroxylase基因可能為T.thermosaccharolyticum類型微生物較強(qiáng)木質(zhì)纖維素降解能力的關(guān)鍵因素。此外,在T.thermosac

7、charolyticum中的木質(zhì)纖維素降解基因中,Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase基因中-10區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)處的單堿基差異可能與T.thermosaccharolyticum類型微生物對(duì)纖維素的利用效果密切相關(guān)。
　　克隆得到了菌株W16[FeFe]-氫化酶hyd和hfs基因簇的完整DNA序列,分別包含hydII(1308bp)、hydC(480bp)、hydD(363bp)、hydB(1

8、788bp)和hydA(1752bp),以及hfsA(243bp)、hfsB(1716bp)和hfsC(1512bp),其中hydII、hydB、hydA、hfsB和hfsC為較重要的氫化酶基因。分析了hyd和hfs基因簇中各基因的DNA序列特征、對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能區(qū)與保守區(qū)?？疾觳煌瑲庀鄺l件(起始N2、H2或CO2灌注)對(duì)氫化酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。對(duì)hyd基因簇,hydA的轉(zhuǎn)錄過程在高H2或高CO2分壓下被