新型低毒性兩親性殼聚糖衍生物的合成及其蛇床子素膠束的研制.pdf

1、目的:合成新型的兩親性殼聚糖衍生物，希望具有較好的安全性和生物相容性，并以其為載體，以疏水性的抗腫瘤藥物蛇床子素（Osthole，OST）為模型藥物，制備OST載藥膠束，通過(guò)膠束疏水層包載藥物，增加藥物溶解性，通過(guò)膠束親水外層促進(jìn)藥物吸收和被動(dòng)靶向，從而改變OST溶解性差、吸收差、分布廣的缺點(diǎn)，增加藥物的抗腫瘤效果。
　　方法:(1)通過(guò)烷基化反應(yīng)，在殼聚糖的自由氨基上連接上三個(gè)甲基，得到親水性的N-三甲基殼聚糖（N-trimet

2、hyl chitosan，TMC），再在游離的氨基上繼續(xù)引入長(zhǎng)鏈軟脂?；蚬秕；?，合成新型的兩親性殼聚糖衍生物，N-癸?；?N-三甲基殼聚糖（N-caprinoyl-N-trimethyl chitosan, CA-TMC）和N-軟脂酰基-N-三甲基殼聚糖（N-palmityl-N-trimethyl chitosan, PA-TMC）。經(jīng)紅外光譜、1H-NMR驗(yàn)證新型聚合物的結(jié)構(gòu)，并通過(guò)元素分析法定量分析引入基團(tuán)的接枝率。采用芘熒光探

3、針法測(cè)定聚合物的臨界膠束濃度。通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、溶血性實(shí)驗(yàn)和急性毒性實(shí)驗(yàn)考查載體的生物相容性評(píng)價(jià)其安全性。(2)以兩親性殼聚糖聚合物為載體，采用不同的制備方法制備OST載藥膠束，以包封率、粒徑和穩(wěn)定性、后續(xù)實(shí)驗(yàn)等因素選取制備方法，再以單因素和正交設(shè)計(jì)等方法優(yōu)化載藥膠束的處方工藝。利用激光粒徑動(dòng)態(tài)分析儀、高分辨率投射電鏡、原子力顯微鏡進(jìn)行表征，并考察不同pH值介質(zhì)中載藥膠體的釋放特性。(3)以O(shè)ST原料藥，采用MTT法篩選敏感的腫瘤細(xì)胞，

4、評(píng)價(jià)OST及其載藥膠束的細(xì)胞毒性，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)探索藥物的作用機(jī)制。采用共聚焦顯微鏡和原子力顯微鏡觀察藥膠束的細(xì)胞靶向性和吸收過(guò)程。
　　結(jié)果:(1)合成了2種新型的殼聚糖衍生物，其結(jié)構(gòu)得到紅外圖譜和1HNMR譜的表征；元素分析法顯示隨著三甲基殼聚糖季胺化程度的升高，疏水基的接枝率降低。聚合物的臨界膠束濃度在0.0016～0.088 mg×mL-1，提示載藥膠束有較好的抗稀釋能力。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明載體對(duì)A549、Hela和HL

5、7702細(xì)胞的抑制作用有隨著載體濃度升高而升高的趨勢(shì)，但總體抑制率較低，具有較好細(xì)胞相容性。溶血實(shí)驗(yàn)表明載體的溶血性遠(yuǎn)低于常用靜脈注射的低分子表面活性劑Tween80而與F188相當(dāng)，說(shuō)明聚合物具在考察濃度范圍內(nèi)，血液相溶性好。CA-TMC的半數(shù)致死量（Lethal Dose50，LD50）值為368.79 mg×kg-1，PA-TMC的LD50為405.31 mg×kg-1，具有較大的LD50；與生理鹽水組相比，給藥組小鼠心肝脾肺腎沒

6、有顯著性差異，說(shuō)明聚合物載體具有良好的組織相容性。安全性實(shí)驗(yàn)表明新型的兩親性殼聚糖衍生物具有較好的生物相容性和安全性。（2）綜合分析考慮選擇超聲法作為載藥膠束的制備方法，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化OST/PA-TMC和OST/CA-TMC載藥膠束制備方法。再此基礎(chǔ)上進(jìn)一步確定最佳制備方法為載體濃度1.0 mg·mL-1，載藥比25%，超聲次數(shù)200次。將不同的載體按此方法制備的載藥膠束使OST在水中的溶解性均有明顯提高。綜合各載體評(píng)分

7、，最終選取最佳載體CA-TMC2進(jìn)一步表征。OST/CA-TMC2載藥膠束平均粒徑((183.6±26.1) nm，PDI為0.079，包封率(79.29±0.76)%，載藥量(20.01±0.07)%。透射電鏡和原子力顯微鏡照片顯示，制得的載藥膠束近球狀，形態(tài)比較圓整，粒徑在180 nm左右。OST/CA-TMC2載藥膠束在pH5.0和pH7.4的釋放介質(zhì)中，釋放行為符合Higuchi方程。（3）實(shí)驗(yàn)表明OST對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7

8、和宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞較為敏感，半數(shù)抑制率（half Inhibitory of the substance Concentration，IC50）分別為55.20μg×mL-1、60.79μg×mL-1。將OST制備成OST/CA-TMC2載藥膠束后，藥物的濃度效應(yīng)范圍更大，能顯著提高抗腫瘤活性。與OST相比OST/CA-TMC2載藥膠束對(duì)Hela更具親和性，抑制作用更顯著。同時(shí)，OST/CA-TMC2載藥膠束沒有改變藥物致MCF

9、-7和Hela細(xì)胞死亡的途徑，還有明顯的促進(jìn)作用。原子力顯微鏡實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞給藥物后，細(xì)胞表面褶皺增加明顯，說(shuō)明吞噬作用正在進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)褶皺增加的范圍恰為1-2個(gè)膠束粒子粒徑，說(shuō)明吞噬作用是藥物進(jìn)入細(xì)胞的一種方式。共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)顯示了OST/CA-TMC2載藥膠束能快速進(jìn)入細(xì)胞，并最終定位于細(xì)胞核，且Hela細(xì)胞核內(nèi)的熒光更為明顯，這一現(xiàn)象從一個(gè)側(cè)面解釋了原料藥對(duì)MCF-7作用略強(qiáng)，而載藥膠束對(duì)Hela細(xì)胞作用略好。