纖維素基復合層析基質(zhì)的功能化與應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、層析技術(shù)由于其分離機制多樣性和操作的相對簡便性，成為新型分離方法和集成化技術(shù)研究的焦點。擴張床吸附層析和疏水性電荷誘導層析是新型層析分離和集成化技術(shù)的典型代表。 在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，本文以纖維素基復合層析介質(zhì)的設(shè)計、制備和應(yīng)用為主線，側(cè)重于基質(zhì)的功能化，開展了四個方面的工作：其一，纖維素球形基質(zhì)的物理性能改進，采用合適的手段，實現(xiàn)基質(zhì)的孔道擴增和密度增大；其二，基質(zhì)的化學改性，對纖維素基質(zhì)進行活化處理，實現(xiàn)功能配基的有效偶

2、聯(lián)；其三，制備功能化的層析介質(zhì)，包括弱陰離子交換擴張床介質(zhì)和疏水性電荷誘導層析介質(zhì)，進行介質(zhì)的性能評價，研究介質(zhì)與目標蛋白的相互作用；其四，應(yīng)用研究，將功能化介質(zhì)應(yīng)用于實際的分離過程，包括固定床層析和擴張床吸附。取得的主要結(jié)果如下： 纖維素基復合層析基質(zhì)的物理功能化：以再生纖維素為骨架，碳化鎢粉末為增重劑，糊化木薯淀粉為制孔劑，采用“反相懸浮熱再生法”和成球后去除淀粉方法，成功制備了纖維素/碳化鎢復合微球，可用作層析介質(zhì)的基質(zhì)。

3、基質(zhì)的物理特點在于大孔徑和高密度，實現(xiàn)了孔徑的可控擴增和密度的可控調(diào)節(jié)。基質(zhì)具有良好的球形外觀和對數(shù)正態(tài)粒徑分布，平均孔徑達到129nm，濕真密度與碳化鎢添加量呈線性相關(guān)，可達2.4mg/ml，孔結(jié)構(gòu)受增重劑的影響較小。復合層析基質(zhì)的柱層析行為表明：大孔型基質(zhì)的洗脫峰形明顯改善，柱壓小，適合于高流速的固定床和擴張床層析；擴張床內(nèi)可形成穩(wěn)定的分級分布，符合擴張床吸附要求；可根據(jù)具體需要，調(diào)節(jié)碳化鎢添加比例來優(yōu)化操作流速和床層擴張率。

4、 纖維素基復合層析基質(zhì)的化學功能化——陰離子交換配基：采用堿化和偶聯(lián)兩步反應(yīng)，將纖維素/碳化鎢復合層析基質(zhì)進行陰離子交換的配基功能化，制備成大孔型、高密度的弱陰離子交換擴張床吸附劑(Cell-TuC-DEAE)，考察了牛血清白蛋白(BSA)的靜態(tài)和動態(tài)吸附性能。結(jié)果表明，靜態(tài)吸附容量達到97.1mg/ml；流速為500cm/h時(擴張床內(nèi)擴張率約為2)動態(tài)吸附容量為66.6mg/ml；當流速高達900cm/h時，動態(tài)吸附容量仍有54.

5、5mg/ml。吸附動力學研究表明，由于介質(zhì)具有大孔結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)擴散傳遞迅速，與溶液中自由擴散基本處在同一個數(shù)量級，驗證了基質(zhì)擴孔的必要性，適用于高流速的擴張床吸附分離。 纖維素基復合層析基質(zhì)的化學功能化——疏水性電荷誘導配基：采用烯丙基溴(AB)和二乙烯基砜(DVS)活化，偶聯(lián)4-巰乙基吡啶(MEP)、2-巰基-1-甲基咪唑(MMI)和2-巰基苯并咪唑(MBI)，將纖維素/碳化鎢復合層析基質(zhì)進行疏水性電荷誘導配基功能化，制備得到

6、四種大孔徑、高密度的疏水性電荷誘導層析(HCIC)介質(zhì)Cell-TuC-AB-MEP，Cell-TuC-DVS-MEP，Cell-TuC-DVS-MMI和Cell-TuC-DVS-MBI?？疾炝朔磻?yīng)條件對活化和偶聯(lián)過程的影響，優(yōu)化了反應(yīng)條件。烯丙基溴活化密度可達137μmol/ml，偶聯(lián)后MEP配基密度為90μmol/ml；二乙烯基砜活化密度達到93μmol/ml，配基偶聯(lián)密度約60μmol/ml。 疏水性電荷誘導層析介質(zhì)與蛋白

7、質(zhì)的相互作用：考察了HCIC介質(zhì)與模型蛋白質(zhì)(卵黃免疫球蛋白IgY和BSA)的相互作用，從吸附平衡、吸附動力學、層析柱保留因子和穿透曲線等方面探討了HCIC介質(zhì)的吸附機理和性能特點。結(jié)果表明，溶液pH和鹽濃度是影響吸附的關(guān)鍵因素。在pH=5左右，即蛋白質(zhì)等電點附近，吸附作用達到最大，IgY靜態(tài)吸附量達到100mg/ml以上；pH升高，吸附容量呈下降趨勢；pH下降到蛋白質(zhì)等電點和介質(zhì)配基的pKα值以下，產(chǎn)生靜電排斥作用，實現(xiàn)解吸。添加鹽可

8、以適度增加介質(zhì)對蛋白質(zhì)的吸附。四種介質(zhì)中吸附量Cell-TuC-DVS-MBI最大，而吸附選擇性Cell-TuC-DVS-MMI和Cell-TuC-AB-MEP較好。Cell-TuC-AB-MEP的洗脫條件最為溫和，而Cell-Tuc-DVS-MBI則需要較苛刻的條件。采用簡化了的擴散模型可以擬合吸附動力學過程，發(fā)現(xiàn)有效擴散系數(shù)相對較小，且隨pH和鹽濃度變化。蛋白質(zhì)穿透實驗表明，功能化介質(zhì)可用于固定床或擴張床吸附分離。 疏水性電

9、荷誘導層析介質(zhì)的應(yīng)用——卵黃免疫球蛋白的分離：選用Cell-TuC-AB-MEP作為層析介質(zhì)，從卵黃稀釋液中分離免疫球蛋白IgY，考察了層析條件對分離效果的影響。結(jié)果表明，采用固定床或擴張床操作模式，均可實現(xiàn)IgY的有效分離。固定床層析時，收率為58.4％，純化因子2.9，純度達到了92％；而擴張床吸附層析時，流速高達500cm/h，收率為48.4％，純化因子2.9，純度仍有89％。結(jié)果驗證了所制備的HCIC功能化介質(zhì)具有良好的IgY吸