中國南海和南極菲爾德斯半島海域沉積物中微生物、蛋白酶的多樣性及有機氮的降解機制.pdf

1、地球表面的70％被海洋所覆蓋，海洋沉積物構(gòu)成了最復雜的微生物生境，其中蘊藏著豐富的微生物資源，據(jù)統(tǒng)計，地球上總的微生物中，位于深海沉積物中的超過50％。深海（除熱液口外）和極地海洋是一個高鹽、低溫的極端環(huán)境，微生物在這種極端環(huán)境條件下生存，必須進化出獨特的適應機制，因而這些微生物在物種、基因組成和生態(tài)功能上具有多樣性。研究海洋沉積物中的微生物的多樣性對闡述全球的生物地球化學循環(huán)是十分關(guān)鍵的。
　　 沉積物中有機氮的降解是海洋生態(tài)

2、系統(tǒng)氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。在海洋中，生物合成的高分子量有機氮（High-Molecular-Weight Organic Nitrogen，HMWON）以顆粒有機氮(particulate organic nitrogen，PON)的形式，從海水表層沉降到沉積物中。PON在微生物的作用下降解為高分子量的溶解有機氮(dissolved organic nitrogen，DON)，DON再經(jīng)過微生物的分解、氨化、硝化和反硝化作用，最終完成整個氮

3、循環(huán)，微生物在整個過程中起著關(guān)鍵的作用，其中硝化反應是氮循環(huán)的限速反應，該步驟的關(guān)鍵酶是氨單加氧酶，編碼該酶的基因為amo，編碼該酶α亞基的基因amoA經(jīng)常被用作研究亞硝化類群的分子標記。因此，海洋沉積物中PON的降解在沉積物整個氮循環(huán)過程中具有非常關(guān)鍵的作用，蛋白質(zhì)是沉積物中PON和DON的重要組成部分，因此產(chǎn)蛋白酶細菌在他們的降解過程中起重要作用。對海洋沉積物中微生物、蛋白酶的研究和amoA基因多樣性的研究對于最終闡明沉積物中氮的循

4、環(huán)機制和開發(fā)新型蛋白酶具有重要的意義。
　　 本論文分別對中國南海的8個沉積物樣品和中國南極長城站附近海域的8個沉積物樣品的微生物多樣性、所產(chǎn)蛋白酶多樣性以及長城站附近沉積物樣品中的amoA基因多樣性進行了系統(tǒng)研究，并分析了中國南海沉積物菌株Bacillus sp.CF12-9分泌的蛋白酶Ba-1的酶學性質(zhì)。
　　 一、中國南海沉積物中產(chǎn)蛋白酶細菌和蛋白酶的多樣性
　　 用酪蛋白明膠培養(yǎng)基，從中國南海水深154-

5、2，456 m不等的8個海洋沉積物樣品中篩選產(chǎn)蛋白酶的細菌菌株。根據(jù)平板上生長的菌落數(shù)統(tǒng)計，沉積物中可培養(yǎng)的產(chǎn)蛋白酶細菌的豐度大約為106個/g，表明在沉積物里存在著大量的產(chǎn)蛋白酶細菌?？偣埠Y選得到不同的菌株78株，對這些菌株16S rDNA序列進行測序，并提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為FJ169962-FJ170039。序列分析表明，除了兩株菌屬于Firmicutes（厚壁菌門）的Bacillus屬，另外的76株均屬于

6、Gammaproteobacteria綱的Pseudoalteromonas、Alteromonas、Marinobacter、Idiomarina、Halomonas、 Vibrio、Shewanella、Pseudomonas或Rheinheimera屬。其中Alteromonas屬(34.6％)和Pseudoalteromonas(28.2％)屬為優(yōu)勢屬。其余的屬分別占了所有菌株的2.6％到7.7％。并且還發(fā)現(xiàn)，在不同位點和不同水

7、深的沉積物里的細菌優(yōu)勢菌是不同的。在最淺的位點E505，主要的產(chǎn)蛋白酶細菌屬是Shewanella，占該位點所有菌株數(shù)的60％，而在所有超過1000m深的沉積物樣品中，主要的產(chǎn)蛋白酶菌為Pseudoalteromonas和Alteromonas。針對篩選到的Gammaproteobacteria菌株，從GenBank數(shù)據(jù)庫里搜索相近菌16S rRNA基因序列，結(jié)果顯示，菌株與GenBank中最為接近的16S rRNA序列大部分來自沒有命

8、名的菌株或者未培養(yǎng)的海洋細菌。有一些菌株，如CF12-14、E505-2、E505-8和E407-8，與其他的已經(jīng)鑒定的細菌種有著非常遠的進化距離，這些菌株可能是一些新種。經(jīng)過進一步的研究，CF12-14和E407-8已經(jīng)分別被鑒定為Idiomarina屬和Rheinheimera屬的新種。
　　 有62株菌能夠產(chǎn)生足夠量的酶用于進行蛋白酶抑制劑實驗。分析絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)，金屬蛋白酶抑制劑鄰菲羅啉(o-

9、phenanthroline，O-P)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和天冬氨酸蛋白酶抑制劑pepstatin A對這些菌株產(chǎn)的蛋白酶活性的抑制效果。結(jié)果顯示，PMSF對所有研究菌株產(chǎn)的蛋白酶的活性都有抑制作用，抑制率為23-100％，表明這些菌株都能夠產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶。O-P對47株菌產(chǎn)生的蛋白酶的活性有抑制作用，抑制率為20-84％，表明這些菌株都能夠產(chǎn)生金屬蛋白酶。大部分菌株產(chǎn)生的胞外蛋白酶的活性能夠同時被PMSF和O-P抑制，表明

10、了這些菌株能夠同時產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。E-64和pepstatin A對菌株產(chǎn)的蛋白酶活性的最高抑制率低于10％，或者無抑制，這表明這些菌株不產(chǎn)或者產(chǎn)極其少量的半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。因此，海洋沉積物中細菌產(chǎn)的胞外蛋白酶可能都是絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。另外，研究了這些菌株產(chǎn)的胞外蛋白酶對酪蛋白、明膠和彈性蛋白的降解能力。結(jié)果表明，有68株菌能夠在酪蛋白或者明膠平板上產(chǎn)生明顯的水解圈，這些蛋白酶對酪蛋白和明膠的降解能力

11、明顯不同。僅有47株菌能夠在彈性蛋白平板上產(chǎn)生較為顯著的水解圈。有一些菌株產(chǎn)的蛋白酶對三種蛋白均有較高的降解活力，比如菌株CF6-2、CF6-14、E505-3、CF12-10和E407-8。進一步研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)seudoalteromonas sp.CF6-2分泌的蛋白酶Pseudoalterin是一個序列新穎的M23家族金屬蛋白酶。以上結(jié)果表明，這些菌株產(chǎn)的蛋白酶可能屬于不同種類的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，其中存在著一些新型的蛋白酶

12、。
　　 二、南極菲爾德斯半島海域沉積物的微生物多樣性
　　 我們采集了中國南極長城站附近Maxwell灣海洋沉積物樣品，利用qPCR技術(shù)對沉積物中的細菌及古菌的16S rDNA及amoA基因序列進行了定量分析，并利用454焦磷酸測序?qū)Τ练e物中的微生物群落進行了分析。
　　 沉積物中，細菌16SrDNA的豐度遠遠超過古菌的，說明了細菌在采集的海洋沉積物樣品中的優(yōu)勢地位。對8個樣品中的細菌和古菌的16S rDNA序

13、列進行測序，總共得到了181231條細菌16S rDNA和95118條古菌16S rDNA序列，提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，登錄號為SRP017144。在8個樣品的群落里，細菌和古菌的OTU數(shù)量分別為2516-4278和403-1221個，該結(jié)果和Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均表明了在所有樣品的群落中，細菌的多樣性高于古菌的多樣性。Good'scoverage指數(shù)顯示，測序得到的序列包含了細菌類群總數(shù)的87.6％-92.5％

14、和古菌類群總數(shù)的94.2％-98.8％。在沉積物樣品中總共發(fā)現(xiàn)了23個細菌門和2個古菌門。其中，細菌的優(yōu)勢類群為Firmicutes和Proteobacteria，分別占了所有序列的61.3％和17.9％，在所有的8個樣品中均出現(xiàn)的共有17個科或類群，這些類群總計占了每個樣品細菌群落的92％以上。在所有的樣品的古菌群落里，均發(fā)現(xiàn)了泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌（Euryarchaeota），除了樣品SS9，沉積物中最多的古

15、菌是廣古菌。Methanomicrobia(40.2％)、Halobacteria(27.7％)、Group C3(12.1％)和Marine Benthic GroupB(11.4％)是主要的古菌類群。值得注意的是，有大量的序列不能歸入任何一個目(order)，尤其是在SS8、SS9和SS13樣品中，該比例分別達到38.6％、70.1％、45.8％，說明在南極沉積物中有著大量新的類群。細菌和古菌的Weighted UniFrac PC

16、oA分析表現(xiàn)出了極其不同的樣式，表明沉積物中的細菌和古菌群落可能受不同因素的影響。
　　 細菌amoA基因拷貝數(shù)比細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)低4-5個數(shù)量級，古菌的amoA基因則未能擴增到目的片段，說明沉積物中氨氧化細菌所占比例較少，而氨氧化古菌更少，以致qPCR定量方法檢測不到，這與454焦磷酸測序的分析結(jié)果是一致的。構(gòu)建了細菌amoA基因的克隆文庫，總計得到了85條序列，分為8個OTU，其中三個較大的OTU總計有78條序

17、列。搜索NCBI數(shù)據(jù)庫和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明，樣品中檢測到的氨氧化細菌的amoA基因均與Nitrosomonadaceae科關(guān)系較近，表明樣品中氨氧化細菌的多樣性較低。
　　 三、南極菲爾德斯半島海域沉積物中產(chǎn)蛋白酶細菌及蛋白酶的多樣性
　　 從南極菲爾德斯半島海域沉積物樣品中篩選到了203個不同的菌株，對這些菌株的16S rDNA序列測序，得到的序列提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為:KC160632-KC1

18、60834。其中有98株能夠在酪蛋白明膠篩選平板上生長，但是不能形成水解圈，另外105株細菌能夠形成水解圈，用于后續(xù)分析。105株細菌分別屬于23個屬，其中5株細菌——菌株SS9.12、SS9.38、SS14.29、SS14.30和SS14.31，它們在進化樹上聚為一簇，并且在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有關(guān)系相近的Bacteroidetes屬，這可能代表了Bacteroidetes門下一個較新的分類單元。
　　 在屬的水平上，每個樣品中

19、的細菌都表現(xiàn)出較高的多樣性。這些細菌屬于Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Proteobacteria四個門?？傮w來說，Bacillus(22.9％)、Flavobacterium(21.0％)和Lacinutrix(16.2％)是優(yōu)勢屬，幾乎在每個樣品中均有發(fā)現(xiàn)，并且形成了豐度最大的類群，這三個屬總共有63株，占了總數(shù)的60％。有14個屬只有一個菌株，占到了全部菌株的16.2％。并且，結(jié)果

20、顯示，在不同的樣品里產(chǎn)蛋白酶細菌的優(yōu)勢菌群是不同的。
　　 多達85株菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)酶量低，不能進行蛋白酶的抑制劑實驗，其余20株細菌的蛋白酶抑制劑實驗表明沉積物中的細菌產(chǎn)生的蛋白酶均為絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。這個結(jié)果與南海沉積物樣品的是一致的。篩選到的105株細菌中57株細菌只能形成微弱的水解圈，只有48株能夠在篩選平板上形成明顯水解圈，它們對酪蛋白和明膠的降解能力展現(xiàn)出了極大的不同，表明這些菌株產(chǎn)的蛋白酶可能屬于不

21、同種類的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。綜上所述，南極沉積物中的細菌產(chǎn)蛋白酶的能力與南海沉積物中的相比較低。
　　 四、菌株Bacillus sp.CF12-9產(chǎn)的胞外蛋白酶Ba-1的分離純化和酶學性質(zhì)研究
　　 Bacillus sp.CF12-9是從南海沉積物中分離到的一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株。蛋白底物固體平板分析表明，該菌株對酪蛋白、明膠和彈性蛋白都有較強的降解能力。我們通過液體發(fā)酵，收集發(fā)酵液，并利用陰離子交換層析的方法，

22、分離純化了菌株Bacillus sp.CF12-9產(chǎn)的一個胞外蛋白酶Ba-1。底物特異性分析顯示，該酶對不同的蛋白質(zhì)底物如酪蛋白、明膠、膠原蛋白和彈性蛋白均有降解活性，該酶的最適酶活溫度為30℃，在0℃時，仍然能保持35％左右的活性，表明該酶為典型的適冷蛋白酶，該酶的最適pH為8.5。蛋白酶抑制劑實驗表明該酶屬于絲氨酸蛋白酶。2mM的K+或Li+能抑制該酶約20％的活性，2mM的Zn2+能夠抑制該酶活性的30％左右，2mM的Fe2+能夠

23、明顯的抑制該酶的酶活，抑制率在80％以上。該酶在無NaCl時酶活最高，0.5 M的NaCl即能抑制該酶活性的20％，說明該酶對NaCl的耐受性較差。對Ba-1進行N端測序，獲得了該蛋白酶N端前15個氨基酸殘基序列:WTPNDYYYQGYQYGP，將得到的序列在NCBI上進行BLAST序列比對，初步確定蛋白酶Ba-1屬于絲氨酸蛋白酶subtilisin家族(S8A)。根據(jù)N端序列，設計兼并引物為正向引物，使用S8A家族保守區(qū)引物RM6為反

24、向引物，擴增得到了Ba-1編碼基因的N端到保守區(qū)的片段，利用TAIL-PCR技術(shù)擴增得到Ba-1的基因序列，全長為1215 bp，編碼了404個氨基酸，分析顯示，M1-A27為信號肽，E55-T124為I9 peptidase inhibitor，W125-Y404為成熟酶。與該蛋白酶氨基酸序列相似度最高的為B.sp.Ak.1產(chǎn)的蛋白酶Ak.1 protease和Geobacillus stearothermophilus產(chǎn)的胞外蛋白酶

25、，相似度高達72％，Ak.1 protease和Geobacillus stearothermophilus產(chǎn)的蛋白酶均在60-70℃保持穩(wěn)定，并且是熱激活蛋白，而Ba-1在35℃保溫30 min幾乎喪失所有的活性。因此，Ba-1與這兩個酶的性質(zhì)差別很大。以上結(jié)果為進一步闡述蛋白酶在深海氮循環(huán)中發(fā)揮的作用提供了有力的理論依據(jù)，并且該酶作為典型適冷酶在需要低溫催化的領(lǐng)域可能有一定的應用前景。
　　 本論文使用高通量測序的方法研究了