燃煤型地方性氟中毒病區(qū)學齡兒童智力和慢性氟中毒仔鼠學習記憶能力改變及干預研究.pdf

1、目的：地方性氟中毒（簡稱地氟?。┦鞘澜缟戏植驾^為廣泛、危害較為嚴重的一種地方病，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷，導致病區(qū)兒童智力低下。但慢性氟中毒對發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)損傷作用機制目前還未完全闡明清楚。為了解燃煤型地方性氟中毒病區(qū)經(jīng)過綜合治理后學齡兒童智力情況我們進行了此次調(diào)查，并通過動物模型和細胞模型進一步探討腦組織中 N-甲基-D-天門冬氨酸( N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體、鈣離子信號傳導通路及氧化應激對慢性氟中

2、毒仔代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和學習記憶能力的損害作用。應用抗氧化劑維生素 E（Vit E）進行干預處理，尋找慢性氟中毒有效防治措施。
　　方法：選擇貴州省畢節(jié)市典型燃煤型地方性氟中毒病區(qū)改爐改灶及健康教育綜合治理時間超過3年的村8-12歲小學生作為治理時間長組，綜合治理時間<1年的村小學生作為治理時間短組，同時選擇畢節(jié)市七星關區(qū)內(nèi)同年齡段小學生作為對照組。采用Dean法進行氟斑牙檢查，氟離子選擇電極法測定尿氟，《瑞文標準推理測驗》檢測智商。

3、通過飲水加氟和 Vit E灌胃處理制備動物模型，實驗動物處理5個月后雌雄大鼠合籠，分別取出生1、7、14、21、28 d仔鼠進行實驗。觀察仔鼠出生后體重變化；記錄仔鼠完成平面翻正、空中翻正、聽覺驚愕、斷崖回避等神經(jīng)反射的時間； Morris水迷宮檢測仔鼠學習記憶能力；HE和尼氏染色觀察仔鼠腦組織形態(tài)改變；腦組織氧化應激指標通過相關試劑盒檢測；免疫組化方法檢測神經(jīng)元核心抗原Neu N，NMDA受體各亞單位（NR1、NR2A、NR2B、NR

4、3A）、CaMK II蛋白在腦組織的表達定位；Western-blotting和 Real-time PCR方法檢測大鼠腦組織和體外培養(yǎng)細胞中 NMDA受體各亞單位蛋白及 mRNA表達水平；流式細胞術檢測仔鼠腦組織和體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞凋亡率；激光共聚焦和流式細胞儀觀察體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞內(nèi)活性氧簇（ROS）和鈣離子（Ca2+）熒光染色。
　　結果：與對照組兒童比較，病區(qū)兒童氟斑牙檢出率和兒童尿氟含量顯著升高，且治理時間短組檢出率高于治理

5、時間長組。智力調(diào)查結果顯示，病區(qū)兒童智商與對照組比較明顯下降，且智商分布與尿氟含量呈負相關。病區(qū)治理時間長與治理時間短兩地兒童的智商分布從整體和性別比較無差異，但在低年齡組兒童中，治理時間長病區(qū)兒童中等以上智商比例高于治理時間短病區(qū)兒童。
　　動物實驗結果顯示，各實驗組仔鼠出生體重無顯著差異，但染氟組仔鼠體重增長緩慢，至出生28 d體重明顯低于對照組和Vit E干預組；完成平面翻正、空中翻正的時間延遲，水迷宮實驗顯示逃避潛伏期延長

6、，探索平臺次數(shù)減少，學習記憶能力下降。HE染色觀察隨仔鼠生長發(fā)育，海馬及神經(jīng)細胞體積增大，染氟組仔鼠腦組織神經(jīng)細胞核比例增大、染色增強；神經(jīng)細胞尼氏染色變淺；神經(jīng)元核心抗原 Neu N表達降低；腦組織細胞凋亡率增高；腦組織 SOD活力下降，MDA含量增加，NO和NOS均呈增高趨勢。Vit E干預組各項指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。NMDA受體各亞單位在仔鼠發(fā)育進程中表達情況為：與新生仔鼠蛋白表達比較，對照組 NR1蛋白表達于出生后2

7、1 d達高峰，以后逐漸下降；NR2A亞基于出生14 d表達明顯升高，并維持至出生后28 d；NR2B亞基蛋白表達于出生28 d時明顯升高；NR3A亞基在仔鼠出生14 d表達最高；phospho-NR2B在仔鼠出生14 d表達升高，并穩(wěn)定維持至出生后28 d；CaMK II于出生14 d表達明顯升高，之后有緩慢下降。染氟組 NR1亞單位在仔鼠出生后7 d升高，之后逐漸下降至新生水平；NR2A亞基于出生28 d表達量最高；NR2B在仔鼠出生

8、14 d時其表達顯著增加，至出生后28 d稍有下降；NR3A亞基表達量無統(tǒng)計學意義；phospho-NR2B在仔鼠出生14 d出現(xiàn)表達升高，并在出生21 d、28 d表達顯著升高；CaMK II蛋白表達無顯著變化。Vit E干預組 NR1亞基表達高峰出現(xiàn)在出生后第14天，持續(xù)至出生后28 d；NR2A蛋白表達于出生后21 d達最高；NR2B亞基蛋白在仔鼠出生14 d時其表達顯著增加；NR3A亞基蛋白在仔鼠出生7 d表達上升，14 d時達

9、高峰，一直維持至出生28 d；phospho-NR2B蛋白在出生14 d后表達升高；CaMK II蛋白在Vit E處理組仔鼠出生后7 d其表達就升高，維持至出生28 d。與對照組及 Vit E處理組同齡仔鼠各亞單位蛋白表達比較，染氟組仔鼠腦組織NR1、 NR2B及phospho-NR2B蛋白表達升高，CaMK II、 NR3A亞基蛋白的表達下降，NR2A蛋白表達無明顯改變。仔鼠腦組織中 NMDA各亞單位 mRNA表達水平隨仔鼠生長發(fā)育，

10、染氟組NR1和NR2b mRNA表達水平有所升高，21d表達最高，28 d表達逐漸下降；NR3a mRNA表達下降；Vit E干預組 NR3a mRNA表達升高。
　　本實驗成功培養(yǎng)了原代神經(jīng)細胞，經(jīng)加氟處理后，隨染氟時間增加，細胞凋亡率升高，細胞內(nèi) ROS和 Ca2+熒光染色增強，NMDA受體中 NR1、 NR2B、phospho-NR2B蛋白表達升高，NR2A表達無明顯改變，NR3A及 Ca MKII表達下降。轉(zhuǎn)錄水平表達發(fā)現(xiàn)

11、，低劑量氟處理時，NMDA各亞單位基因的表達無明顯變化，高濃度氟處理后，NR2B mRNA表達升高，NR3A mRNA表達下降。通過抗氧化劑 Vit E預處理后，細胞凋亡下降，細胞內(nèi) ROS熒光強度明顯下降，Ca2+熒光強度也有一定降低。
　　結論：以上研究結果表明，（1）地方性氟中毒病區(qū)學齡兒童氟中毒情況仍較重，經(jīng)過長時間綜合治理后的病區(qū)兒童氟斑牙及尿氟含量下降，低年齡兒童智力明顯改善。（2）慢性氟中毒可對仔代生長發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)